1、悅肝膠囊對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞抗衰老作用的研究【關(guān)鍵詞】悅肝膠囊；,衰老；,大鼠肝細(xì)胞摘要：目的討論悅肝膠囊的抗衰老作用。方法以D半乳糖誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞衰老模型，觀察悅肝膠囊對(duì)肝細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造、組織化學(xué)以及對(duì)SD、DA活性的影響。結(jié)果悅肝膠囊可明顯降低DA含量，進(jìn)步SD活性；組織化學(xué)及超微構(gòu)造觀察說(shuō)明，模型組SDH活性下降，AP活性增高，線粒體明顯腫脹、變性、嵴斷裂。悅肝膠囊可減輕上述肝損傷程度。結(jié)論悅肝膠囊對(duì)D半乳糖損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：悅肝膠囊；衰老；大鼠肝細(xì)胞Abstrat：bjetiveTbservetheantiagingeffetsfYueganapsule.ethd

2、sHepatytesinjurydelsereinduedbyDgalatseinratsinvitr,andtreatedithYueganapsule.Struture,ytheistryfrathepatytesandeffetfSD,DAativitieserebserved.ResultsYueganapsuledereasedthententfDAandinreasedSDativity.Ardingtthebservatinfhistheistryandultrastruture,itshedthatSDHativitydereased,APativityinreased,the

3、ithndrinselledandbeaedefred,restbrke.Yueganapsulealleviateddenatureddegreeabve.nlusinTheYueganapsulehasprtetiveeffetsnDgalatsEinduedinjuryfpriaryulturedrathepatytes.Keyrds：Yueganapsule；Aging；Rathepatytes悅肝膠囊主要由葛根、丹參、西洋參、麥冬等4味中藥水提物按適當(dāng)比例配制而成的復(fù)方中成藥。此藥對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞四氯化碳損傷具有良好的保護(hù)作用。為討論悅肝膠囊是否具有抗衰老作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了悅肝膠囊對(duì)

4、D半乳糖所致衰老大鼠肝細(xì)胞氧自由基相關(guān)指標(biāo)的影響，以及肝細(xì)胞超微構(gòu)造、組織化學(xué)的改變，為尋找有效的抗衰老藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。1材料與方法1.1動(dòng)物istar系大鼠乳鼠，鼠齡15d，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。1.2藥物與試劑悅肝膠囊由延邊大學(xué)長(zhǎng)白山天然藥物研究中心提供。制備方法：葛根30g，丹參30g，麥冬20g，西洋參20g，加蒸餾水煮1h后過(guò)濾，濾出液備用，把原藥再煮1h后過(guò)濾，把第1次濾出液和第2次濾出液混合，濃縮成100l即得。D半乳糖為上海試劑二廠產(chǎn)品。批號(hào)為980218人參皂苷為吉林省白山市靖宇縣黃封參藥業(yè)公司產(chǎn)品，用RPI1640培養(yǎng)液配成300g/l濃度用于實(shí)驗(yàn)，新生小

5、牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品，RPI1640培養(yǎng)基為日本株式會(huì)社產(chǎn)品，胰蛋白酶為美國(guó)DIF公司產(chǎn)品，膠原酶為美國(guó)SIGA化學(xué)公司產(chǎn)品。SD、DA試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3儀器超凈工作臺(tái)為北京昌平長(zhǎng)城凈化設(shè)備廠產(chǎn)品，日本P23232E型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，日本LYPUS倒置顯微鏡，日本JE1200EX型透射電鏡,日本LYPUS萬(wàn)能顯微鏡,芬蘭K3酶標(biāo)儀,德國(guó)ZK15超低溫高速離心機(jī),北京天地百年科技TD2000真彩色病理細(xì)胞顯微分析系統(tǒng)。1.4方法取日齡15d的istar系大鼠乳鼠，無(wú)菌條件下取肝臟，磷酸緩沖液中去漿膜，切成小塊，放入0.5g/L膠原

6、酶和0.6g/L胰蛋白酶等量混合液內(nèi)冷消化，經(jīng)離心制成細(xì)胞懸液，接種于含有200g/L小牛血清的RPI1640培養(yǎng)基內(nèi)，原代單層培養(yǎng)34d，取生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)瓶40瓶分為4組。正常對(duì)照組每隔3d更換培養(yǎng)基；模型對(duì)照組參加8g/LD半乳糖；藥物對(duì)照組參加8g/LD半乳糖+300g/l人參皂苷；實(shí)驗(yàn)組參加8g/LD半乳糖+500g/l悅肝膠囊。作用24h后，模型對(duì)照組換接種培養(yǎng)基；藥物對(duì)照組換加有300g/l人參皂苷的培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組換加有500g/l悅肝膠囊的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。1.5細(xì)胞化學(xué)觀察取生長(zhǎng)蓋玻片，顯示SDH、APase。SDH顯示采用亞鐵氰化甲法；APase顯示采用Gri法；染色后用日本L

7、YPUS萬(wàn)能顯微鏡觀察拍片并利用病理顯微分析系統(tǒng)進(jìn)展定量分析每組隨機(jī)選4張蓋玻片，每張蓋玻片再隨機(jī)選3個(gè)視野，在400下，測(cè)定每個(gè)視野顆粒面積百分比。1.6電鏡標(biāo)本觀察取生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)瓶，按電鏡標(biāo)本制作常規(guī)方法制作標(biāo)本，JE1200EX型透射電鏡觀察并拍片。1.7生化測(cè)定SD活性按黃嘌呤氧化酶法；DA含量按硫代巴比妥酸法1。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以s表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展方差分析。2結(jié)果2.1超微構(gòu)造正常組肝細(xì)胞核圓，核仁明顯，核膜明晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常成群分布于核周及線粒體周圍，呈平行排列。線粒體構(gòu)造正常。模型組線粒體腫脹變性、嵴消失，溶酶體增多。悅肝膠囊組仍有少數(shù)線粒體腫脹、

8、變性改變，但程度較模型組明顯減輕。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.2組織化學(xué)2.2.1琥珀酸脫氫酶SDH染色結(jié)果SDH活性在光鏡下顯示為紫藍(lán)色顆粒。正常組SDH活性強(qiáng)，顆粒多，染色深。模型組SDH活性減弱，紫藍(lán)色顆粒減少，染色淺。藥物對(duì)照組及藥物組SDH活性均較模型組增強(qiáng)，顆粒多，染色深。2.2.2酸性磷酸酶AP染色結(jié)果AP活性呈棕黑色沉淀。正常組AP活性弱，酶顆粒染色較淺，均勻一致。模型組AP活性增強(qiáng)，顆粒多，染色深。藥物對(duì)照組與藥物組AP活性均減弱，顆粒染色較淺。結(jié)果見(jiàn)表1。表1各組肝細(xì)胞細(xì)胞化學(xué)染色酶顆粒定量分析結(jié)果略與正常組比擬，#P0.01；與模型組比擬，*P0.01；n=122.3生化指

9、標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。表2各組肝細(xì)胞SD、DA的影響略與正常組比擬，*P0.01；與模型組比擬，#P0.01；n=123討論衰老“代謝失調(diào)學(xué)說(shuō)是目前被公認(rèn)的一種衰老學(xué)說(shuō)，據(jù)此有人研究出D半乳糖亞急性衰老模型。D半乳糖亞急性衰老模型的形成機(jī)理是在一定時(shí)間內(nèi)給動(dòng)物連續(xù)注射D半乳糖，使細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，其在醛糖復(fù)原酶的催化下復(fù)原成半乳糖醇，這種物質(zhì)不能進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，從而影響細(xì)胞正常浸透壓，使細(xì)胞腫脹，膜構(gòu)造和生理功能紊亂，最終導(dǎo)致衰老的發(fā)生。此模型是當(dāng)前抗衰老研究的較好模型，因此，本實(shí)驗(yàn)亦選用此方法制作了衰老大鼠肝細(xì)胞模型。線粒體是細(xì)胞的能量代謝中心。已有許多研究報(bào)道，衰老時(shí)線粒體發(fā)生腫

10、脹、變性、數(shù)量減少等一系列退行性改變，因此，線粒體被認(rèn)為在細(xì)胞衰老過(guò)程中具有重要的作用2。琥珀酸脫氫酶SDH是在檸檬酸循環(huán)中，催化琥珀酸與延胡索酸之間反響的一種酶。它存在于所有有氧呼吸細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜，是線粒體內(nèi)膜的標(biāo)志酶。SDH活性的變化與線粒體損傷同時(shí)出現(xiàn)，與線粒體的數(shù)目平行升降。因此，SDH可代表線粒體能量代謝，SDH的活性變化可作為線粒體損傷程度檢測(cè)的敏感指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)中觀察到衰老模型組與正常組相比，肝細(xì)胞內(nèi)SDH活性明顯降低；而給藥組與衰老模型組相比，肝細(xì)胞內(nèi)SDH活性明顯增強(qiáng)。這一結(jié)果說(shuō)明衰老時(shí)較多線粒體的變性、壞死導(dǎo)致SDH活性降低，使細(xì)胞能量供給缺乏，從而影響肝的功能;悅肝膠

11、囊可以減少線粒體的變性壞死，進(jìn)步SDH活性，促進(jìn)細(xì)胞能量代謝，增強(qiáng)細(xì)胞有氧呼吸，延緩肝細(xì)胞的衰老進(jìn)程。酸性磷酸酶AP主要存在于溶酶體內(nèi)，是溶酶體的標(biāo)志酶，研究說(shuō)明肝細(xì)胞衰老、死亡時(shí)溶酶體膜脆性及通透性增強(qiáng)，致使溶酶體內(nèi)AP等水解酶滲入胞質(zhì)，從而加速細(xì)胞的變性、壞死過(guò)程3，4。本實(shí)驗(yàn)中觀察到衰老模型組與正常組相比，肝細(xì)胞內(nèi)AP活性明顯升高；而給藥組與衰老模型組相比，肝細(xì)胞內(nèi)AP活性明顯降低。說(shuō)明悅肝膠囊可能降低了溶酶體膜的脆性及通透性，阻止溶酶體內(nèi)AP等酸性水解酶的釋放，使肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)定，減少了肝細(xì)胞的損傷。超氧化物歧化酶SD作為體內(nèi)重要的抗氧化酶，它能使超氧化物陰離子自由基變?yōu)檫^(guò)氧化氫和

12、氧離子，從而減少脂質(zhì)過(guò)氧化反響，使機(jī)體細(xì)胞和組織免受損傷。當(dāng)機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡時(shí)就會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，最終形成過(guò)氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物之一是丙二醛DA,因此通過(guò)測(cè)定DA可以間接反映體內(nèi)自由基產(chǎn)生和老化程度5。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：衰老模型組與正常組、悅肝膠囊組相比擬SD活性、DA含量均有顯著差異，P0.05。說(shuō)明D半乳糖所致的肝損傷中有大量自由基產(chǎn)生，悅肝膠囊能使衰老小鼠肝細(xì)胞SD活性增強(qiáng)、DA含量降低，這可能與悅肝膠囊的抗氧化作用有關(guān)。總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，悅肝膠囊對(duì)D半乳糖損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。，其機(jī)理可能是悅肝膠囊阻止脂質(zhì)過(guò)氧化，以保護(hù)肝細(xì)胞的膜性構(gòu)造不被破壞，阻止了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的損傷，其確切的作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1陳嘯梅.組織化學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：224.2李質(zhì)馨，朱辛為，徐冶，等.胎腦提取液對(duì)衰老小鼠肝細(xì)胞酶活性影響的實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)