1、RNA 干 擾 技 術提綱第一部分 RNA干擾理論基礎一、RNA干擾概述二、 RNA干擾的機理第二部分 RNA干擾技術應用一、小干擾RNA(siRNA)序列設計二、 siRNA的合成三、 siRNA的轉染第三部分 RNA干擾在中藥學上的應用展望一、RNA干擾概述1、 RNA干擾定義2、 RNA干擾簡介3、 RNA干擾研究簡史一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAi）。 1、 RNA 干擾定義2、 RNA干擾簡介RNAi的發現具有劃時代的意義，它不僅深入揭示了細胞內基因沉默的機

2、制，而且它還是后基因組時代基因功能分析的有力工具，極大地促進了人類揭示生命奧秘的進程；此外， siRNA本身還是一種極具前景的基因靶向藥物，可廣泛地用于諸如癌癥等疾病的治療。鑒于siRNA技術的巨大意義與廣闊應用前景，2002年美國科學雜志將其評為全球年度十大科學進展之首。3、RNAi 研 究 史 20多年前，在對矮牽牛花（petunias）進行的研究中發現協同抑制現象cosuppression，導入的基因和其相似的內源基因同時都被抑制。 1995年，康奈爾大學的研究生Su Guo（郭蘇）用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發現，反義和正義RNA都阻斷了基因的表達。結果出乎意料。；三年后，Fi

3、re等真正起作用的是微量雙鏈RNA（污染），注入雙鏈RNA到線蟲中發現比注入單鏈更有效，隨后發展了通過RNAi進行線蟲基因敲除的策略。 在果蠅的研究中同樣發現RNAi。通過顯微注射或者通過基因槍將dsRNA注入果蠅胚胎中能夠引發基因沉默。在過去的幾年中RNAi技術在果蠅的研究中成為一種反向遺傳工具，用于鑒定功能缺失表型。 2001年Elbashir等 Nature上首次報道通過21個核苷酸的siRNA成功地在哺乳動物培養細胞中誘導特異性基因沉默。隨后，在小鼠等多種細胞中也取得了成功。 牽牛花（petunias）協同抑制現象cosuppression，RNAi機制模式圖在起始步驟，加入的dsRN

4、A被Dicer酶切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段 在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex, or RISC） 激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上激活RISC需要一個ATP依賴的將siRNA解雙鏈的過程并在距離siRNA3端12個堿基的位置切割mRNA Degradation of the target mRNA (引起靶標mRNA的降解),Inhibition of translation of the target mRNA (抑制靶標mRNA的翻譯),

5、Silencing the gene transcription from the target promoter (引起靶標啟動子的轉錄沉默).The targets of the RNAi-directed gene silencing（RNA干擾指導的基因沉默的結果）：第二部分 RNA干擾技術應用一、小干擾RNA(siRNA)序列設計二、 siRNA的合成三、 siRNA的轉染一、小干擾RNA(siRNA)序列設計1、 siRNA的一般結構2、siRNA靶位點的選擇siRNA的一般結構：哺乳動物：21-23bp dsRNA 非哺乳動物：長片段dsRNAdTdT（UU）（UU）dTdT1、

6、 siRNA的一般結構序列同源性分析： 將siRNA序列和相應的基因組數據庫（人，或者小 鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列 / EST同源的序列。例如進行BLAST搜索分析（ /BLAST/） 選出合適的目標序列進行合成 并非所有符合條件的siRNA都一樣有效，其原因還不清楚，可能是位置效應的結果，因此對于一個目的基因，一般要選擇3-5個靶位點來設計siRNA設計陰性對照 通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查 結果以保證它和其他基因沒有同源性。或者用housekeeping genes 作對照.補充：Whitehead 研究所已研發了siRNA的自動選擇方法，并于網

7、站：/bioc/siRNA/home.php 上向公眾開放這個軟件允許使用者定義序列基序和G/C含量，并自動在人和鼠的基因組數據庫中搜索siRNA序列，以防錯配。疑難解答： 假如siRNA不起作用，應首先確定所使用的靶序列和細胞是 否來源于相同的組織。是否使用了錯誤的細胞系。 應確定用于進行RNAi的siRNA雙鏈對選擇的mRNA序列是否 可靠的，因后者可能包含序列上的錯誤、突變（如在癌細胞 中）或存在多態性。二、 siRNA的合成1、化學合成2、體外轉錄 3、用RNase 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA 4、體內表達1、化學合成許多公司可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要

8、的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成34對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。 最適用于：已經找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究 不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素 雙鏈 RNA合成 非特異siRNA合成體外轉錄法合成 siRNA2、體外轉錄3、非特異性siRNA合成 大腸桿菌RNase III是一種識別雙鏈 RNA的內切酶，產物為 3端外懸2-3個堿基的雙鏈短片段，與 Dicer在真核生物RNAi途徑中相同。利用RNase III 消化得到的

9、siRNA混合物直接轉染細胞，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。優點：可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節省時間和金錢。缺點：有可能引發非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因。 siRNA表達載體在細胞中表達siRNAs 以PCR制備的siRNA表達框進行體內轉錄 利用病毒系統實現體內表達siRNA4、體內轉錄合成 siRNA優點：不需要直接操作RNA siRNA表達載體BD Knockout RNAi vectorsSiRNA 的 轉 染RNAiFect Transfection Reagent siRNA 轉染專用試劑，使用簡單。轉染方法： 1 磷酸鈣共沉淀;

10、 2 電穿孔法; 3 DEAE-葡聚糖 4 機械法 5 陽離子脂質體試劑注意事項： 1 純化 siRNA ； 2 避免RNA酶污染 3 細胞培養和操作嚴格 4 避免使用抗菌素 5 選擇合適的轉染試劑 6 合適的陽性對照 7 通過標記siRNA來優化實驗第三部分、RNAi技術在中藥學上的的應用一、 RNAi在證候-基因組研究中的應用二、 RNAi在中藥生產中的應用老子說:“萬物負陰而抱陽”；易經說：“一陰一陽謂之道”。有過多的mRNA,siRNA就會與之結合,進而把它降解來完成機體的自穩(陰陽的對立制約), mRNA的降解進而又轉換成siRNAs以繼續執行功能(陰陽的相互轉化),siRNAs和m

11、RNA互根互用、消長平衡來完成機體的自穩及清除外來的病原體。siRNA（陰）mRNA（陽）一、RNAi在證候-基因組研究中的應用證候研究是中醫科學研究的重點和難點,也是制約中醫發展的頸瓶。人類基因組學研究的方法學內容與中醫學的整體觀、辨證觀有許多相似之處。在微觀水平的基因調控與修飾,反映著生命機體的整體功能狀態,基因組的多樣性高度強調了每個人的基因特異性。因此如何揭示證的本質,如何把證候和現代科學聯系起來是值得中醫研究者去思考的。一、RNAi在證候-基因組研究中的應用廣州中醫藥大學脾胃研究所通過基因芯片研究,篩選出了脾氣虛證核糖體蛋白下調基因RPS20、RPS29、RPL35、RPL27;同時

12、也進行了脾氣虛證異病同證差異基因研究,通過收集潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)脾氣虛證及濕熱證患者結腸病變黏膜,制作核糖體蛋白的低密度芯片,篩選出多條下調基因。證候基因組學的深入發展必然要求對這些基因的功能進行綜合評價,尋找其中的關鍵基因,并明確差異基因相互作用的關系,對證候本質進行深入研究。一、RNAi在證候-基因組研究中的應用因此,在此基礎上,該所采用RNAi技術在IEC-6細胞上對脾虛證關鍵基因RPS20的功能進行了鑒定。結果提示,干擾IEC-6細胞RPS20后,細胞形態結構發生改變,細胞遷移、增殖能力受到抑制,表明小腸上皮細胞可能存在著消化吸收功能低下及黏膜修復減慢趨勢。此結果說明了RPS20可能在脾虛證發生發展中起到了重要的作用。 RNA 干擾是一種新型反義技術, 即把dsRNA 導入細胞引起同源mRNA 降解， 可抑制特異基因的表達, 對藥用植物次生代謝產物的生物合成途徑進行調控, 達到調控天然產物生物合成的目的. 張蔭麒利用反義DNA或RNA 片段導入亞麻植物毛狀根中抑制肉桂醇脫氫酶活性, 使分支代謝中木質素的合成受到抑制, 而使主要抗癌活性成分5-甲氧基鬼臼素的含量提高.二 RNAi在中藥生產中的