1、干旱脅迫對水稻類囊體膜蛋白質組的變化研究導 師：梁建生 研究生：王 琳干旱脅迫對水稻類囊體膜蛋白質組的變化研究導 師：梁建生 研目 錄1、 研究背景及意義2、 研究內容及研究目標3、 研究方案及可行性分析4、 本研究的特色與創新之處5、 研究計劃及預期研究結果6、 研究基礎目 錄1、 研究背景及意義水稻是世界上最重要的三大糧食作物之一，養活了世界一半以上的人口。水稻也是我國的第一大農作物，在糧食生產和國民經濟中起著極其重要的作用。 1、研究背景及意義水稻是世界上最重要的三大糧食作物之一，養活了世界一半以上的人影響水稻產量的因素產 量 增 加培育高產新品適宜生長條件加強管理病蟲害惡劣環境疏于管理

2、產 量 降 低 水 稻影響水稻產量的因素產 量 增 加培育高產新品適宜生長條水分虧缺造成的植物生長減緩和作物減產的損失超過了其他逆境因素減產的總和。 水分虧缺造成的植物生長減緩和作物減產的損失超過了其他逆境因素干旱脅迫對水稻生理生化的影響 當干旱等逆境來臨時，植物可以主動感知環境刺激信號并激發各種抗旱反應。干旱影響光合作用主要是通過氣孔限制和非氣孔限制兩個因素造成的。干旱脅迫對水稻生理生化的影響 當干旱等逆境來臨時葉片生長受抑制光合有效面積降低氣孔導度下降類囊體膜上光能的吸收、傳遞ATP合成的抑制。羧化效率降低干旱干旱對水稻光合作用的影響葉片生長受抑制光合有效面積降低氣孔導度下降羧化效率降低干

3、旱干類囊體光合作用的光反應場所 四種復合體（光合系統IPSI，光合系統IIPSII，ATP合成酶系，細胞色素b6/f復合體）至少含有70種蛋白質用以完成光合反應。蛋白質在質體基因組與核基因組的協同表達，蛋白質積累和合成許多輔助蛋白的協同作用機制都是需要解決的問題。類囊體光合作用的光反應場所 四種復合體本實驗選用基因組測序完成的日本晴作為材料，將干旱脅迫對水稻葉片的光合特性的影響和對水稻類囊體膜蛋白質組的影響相結合進行研究，以期從微觀的蛋白質組水平上闡明宏觀上干旱影響水稻光合生理的機制。為培育抗干旱的高產水稻新品種提供理論依據和實驗依據。研究意義本實驗選用基因組測序完成的日本晴作為材料，將干旱脅

4、迫對水稻葉1、干旱脅迫對水稻生理活性的影響2、干旱脅迫對水稻類囊體膜蛋白質組的影響 3、干旱脅迫對水稻光合生理變化的調控機理 2.1 研究內容2、研究內容及目標1、干旱脅迫對水稻生理活性的影響2.1 研究內容2、研究 2.1.1 干旱脅迫對水稻生理活性的影響干旱不但明顯降低了植株的凈光合速率，使葉綠體超微結構損壞，葉綠素含量降低，而且降低了Rubisco酶和碳酸酐酶等酶的活性。干旱也影響了其他與光合作用有關的生理生化過程，如降低氣孔導度，使光合產物運輸受阻等。當干旱達到一定程度，植物的光合機構就會遭到破壞，使光合能力出現大幅的下降。 2.1.1 干旱脅迫對水稻生理活性的影響收集處理和對照葉片處

5、理移栽育秧選種日本晴測光合速率，熒光等生理指標移栽于水培池中干旱處理收集處理和對照葉片處理移栽育秧選種日本晴測光合速率，熒光等生 類囊體膜有四種復合體（光合系統IPSI，光合系統IIPSII，ATP合成酶系，細胞色素b6/f復合體），它們各自又都有著輔助蛋白。這四種復合體至少含有70種蛋白質用以完成光合反應。干旱會引起類囊體膜上光能的吸收、傳遞和ATP合成的抑制。 2.1.2 干旱脅迫對水稻類囊體膜蛋白質組的影響 2.1.2 干旱脅迫對水稻類囊體膜蛋白質組的影響 2.1.3 干旱脅迫對水稻光合生理變化的調控機理 干旱是導致水稻光合潛能不能充分發揮、進而導致產量降低的最重要的環境因素。從蛋白質組

6、水平可以更好地闡明干旱脅迫影響水稻光合生理的機制，如對光合作用光能利用效率和碳同化作用調節機理的認識等。 2.1.3 干旱脅迫對水稻光合生理變化的調控機理 干2.2 研究目標（1）干旱處理條件下水稻生理生化特性（2）建立或完善一套符合本實驗室的葉綠體（及其亞組分）膜蛋白的提取和鑒定方法（3）建立干旱處理的類囊體膜蛋白質組的變化圖譜（4）初步闡明干旱脅迫影響水稻光合生理的機制2.2 研究目標（1）干旱處理條件下水稻生理生化特性2.3 擬解決的關鍵問題（1） 如何簡單有效分離高純度的類囊體膜蛋白 （比如尋找適合水稻類囊體膜蛋白質組研究的 裂解液配方等）（2） 水稻類囊體膜蛋白質組圖譜的建立（3）

7、推斷水稻光合作用受干旱脅迫的響應機理以 及植物對干旱環境的適應機制2.3 擬解決的關鍵問題（1） 如何簡單有效分離高純度的類3. 主要的實驗方法3.1 生理指標的測定方法（1）土壤含水量的測定 土壤含水量（）（土壤濕重土壤干重）/土壤濕重100（2）葉片水勢的測定葉片水勢用壓力室法（Soilmoisture）測定。（3）葉片光合速率、氣孔導度和葉綠素熒光參數的測定用LI-6400P光合儀測水稻倒二葉的光合速率和氣孔導度。用葉綠素熒光儀測水稻倒二葉葉綠素熒光參數。3. 主要的實驗方法3.1 生理指標的測定方法完整葉綠體沉淀破碎葉綠體1.2mol/L蔗糖梯度液1.5mol/L蔗糖梯度液圖2 蔗糖密

8、度梯度離心后各梯度的組分示意完整葉綠體沉淀破碎葉綠體1.2mol/L蔗糖梯度液1.5mo加入10倍體積的含0.07巰基乙醇的丙酮類囊體膜-20沉淀45min4，35000g離心15min10倍體積的含10TCA的丙酮溶液加入4，35000g離心15min沉淀物適量Lysis Solution I加入37，水浴1hr同時充分攪拌且超聲波震蕩3次20，19000g離心15min取上清液沉淀物10倍體積的含0.07巰基乙醇的丙酮-20沉淀1hr加入4，35000g離心15min重復23次真空凍干圖2 蛋白質提取流程圖3.2 類囊體膜蛋白質的提取加入10倍體積的含0.07巰基乙醇的丙酮類囊體膜-203

9、.3 Western blotting法鑒定類囊體膜 3.3 Western blotting法鑒定類囊體膜 類囊體膜蛋白質組的Western blotting結果A、B分別是用抗PSI抗體、抗LHCII抗體檢測的結果； 泳道1、2的上樣量分別為50g、100g；AB1212118kDa90kDa49kDa35kDa26kDa19kDaPSILHCII圖3 水平半干式電泳印跡示意水平半干式電泳印跡示意類囊體膜蛋白質組的Western blotting結果AB1蛋白質組學研究方法樣品全息制備雙向凝膠電泳圖像分析質譜和蛋白質鑒定蛋白質組學研究方法樣品全息制備雙向凝膠電泳圖像分析質譜和蛋白The C

10、omplete Proteomics Solution Sample PrepImage acquisitionImage analysisSample labelling2D SeparationAutomated spot pickingAutomated spot digestionAutomated MALDI spottingMSLaboratory workflow systemThe Complete Proteomics Soluti樣品制備固相pH 梯度膠條的水化第一向等電聚焦第二向SDS檢測染色3.4 雙向電泳樣品制備固相pH 梯度膠條的水化第一向第二向檢測染色3.4 硝酸

11、銀染色電泳后的凝膠 固定液固定，脫色搖床振蕩1h敏化液增敏 30min銀染液搖床振蕩 20min顯色液顯色， 大約3min終止液停顯10min 水洗5min,重復3次水洗5min,重復3次染色后的凝膠 硝酸銀染色電泳后的凝膠 固定液固定，脫色搖床振蕩1h敏化液增3.5 圖像分析凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點檢測和定量：凝膠配比：數據分析：數據呈遞和解釋：2-DE數據庫的建立：3.5 圖像分析3.6 數據庫比對差異蛋白質Mascot Wizard軟件（Matrix Science Ltd.），設置適當的參數和數據庫，對目的蛋白質的PMF進行網上數據庫匹配。根據實際等電點和分子量以及匹配的結果確定

12、與目的蛋白質的PMF最相符的蛋白質。3.6 數據庫比對差異蛋白質Mascot Wizard軟件（3.7 可行性分析（1）本實驗所提出的技術路線和實驗方案是 切實可行的；（2）本研究所涉及的一些關鍵技術和研究方法 都是本實驗室的常規方法； （3）本實驗是由工作多年的青年教師完成， 長期從事蛋白質化學和蛋白質組學方面的 研究工作，積累了比較豐富的經驗。3.7 可行性分析（1）本實驗所提出的技術路線和實驗方案是 4、本研究的特色與創新建立水稻蛋白質組學研究的技術平臺建立了一套分離純化水稻葉綠體和類囊 體膜蛋白并對其鑒定的系統方法。建立研究水稻（日本晴）響應干旱后類 囊體膜蛋白質組的變化以及闡明干旱脅

13、 迫影響水稻光合生理的機制的系統方案4、本研究的特色與創新建立水稻蛋白質組學研究的技術平臺第一階段：栽培獲取材料和生理數據的測定。第二階段：類囊體膜的分離、提取蛋白第三階段：雙向電泳和圖像分析第四階段：差異點進行質譜鑒定，網上搜庫比對第五階段：整理數據，完成論文5.1 研究計劃5、研究計劃及預期結果第一階段：栽培獲取材料和生理數據的測定。5.1 研究計劃5、5.2 預期研究結果（1）測定干旱處理條件下水稻生理生化特性（2）建立或完善一套符合本實驗室的葉綠體 （及其亞組分）膜蛋白質組學的研究方法（3）建立干旱處理的水稻類囊體膜蛋白質組 的雙向電泳圖譜，初步闡明干旱脅迫影響 水稻光合生理的機制5.

14、2 預期研究結果（1）測定干旱處理條件下水稻生理生化特6.1 工作基礎土壤干旱處理水稻樣品培育技術土壤含水量的測定技術水稻蛋白質的提取和定量技術蛋白質免疫印跡技術 雙向電泳技術銀染和考染技術圖象分析技術水稻蛋白質的原位酶解技術質譜分析技術 6、研究基礎6.1 工作基礎土壤干旱處理水稻樣品培育技術 6、研究基礎6.2 前期研究工作的積累 隨著干旱進行，土壤含水量迅速下降，但兩品種的土壤含水量下降的速度和程度存在比較大的差異。9311的土壤含水量的下降速度和程度大于日本晴的土壤含水量。圖3 停止灌水后土壤含水量的變化（1）土壤干旱對土壤含水量(SWC)的影響6.2 前期研究工作的積累隨著干旱進行，

15、土壤含水量迅速下降，（2）土壤干旱對水稻葉片水勢的影響 隨著停止灌溉時間的延長，9311和日本晴葉片水勢均呈現明顯下降趨勢，品種間差異與土壤含水量的變化相似。圖4 土壤干旱對水稻葉片水勢的影響（2）土壤干旱對水稻葉片水勢的影響 隨著停止灌溉時間的延長，（3）土壤干旱和強光處理對葉片光合速率的影響圖5 土壤干旱和強光對水稻葉片光合速率的影響上圖為日本晴，下圖為9311。箭頭表示重新灌水時間葉片的光合速率隨著土壤干旱程度的不斷加劇而下降，兩水稻品種表現出類似的變化趨勢。復水后葉片的光合速率又恢復到干旱前的水平。強光對兩品種葉片光合速率有顯著的抑制作用（即光抑制），且抑制的程度隨干旱程度的加劇而加重。（3）土壤干旱和強光處理對葉片光合速率的影響圖5 土壤干旱和（4）干旱和強光對葉片葉綠素熒光特性的影響隨著干旱程度的加深， 日本晴的Fv/Fm迅速下降，復水以后重新回升。光抑制的情況下，Fv/Fm下降更為顯著。Fv/Fm呈現相似的變化趨勢，但是強光處理對Fv/Fm的變化影響不大圖6 土壤干旱和強光對水稻日本晴葉片PS II光化學量子產量的影響（4）干旱和強光對葉片葉綠素熒光特性的影響隨著干旱程度的加深（5）水稻葉片葉綠體提取和完整率的鑒定 采用差速離心和蔗糖密度梯度離心等方法所獲得的葉綠體 經過熒光顯微鏡和光學顯微鏡檢測，完整率和純度高。 AB圖7 分離獲得的水稻葉片