1、1 一 光學顯微鏡歷史顯微鏡及熒光顯微鏡原理第1頁17世紀中葉，英國胡克和荷蘭列文胡克，都對顯微鏡發展作出了卓越貢獻。1665年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動和微動調焦機構、照明系統和承載標本片工作臺。這些部件經過不停改進，成為當代顯微鏡基本組成部分。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第2頁16731677年期間，列文胡抑制成單組元放大鏡式高倍顯微鏡，其中九臺保留至今。胡克和列文胡克利用自制顯微鏡，在動、植物機體微觀結構研究方面取得了出色成就。 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第3頁Abbe & Zeiss Ernst Abbe together with Carl Zeiss published a paper i

2、n 1877 defining the physical laws that determined resolving distance of an objective. Known as Abbes Law Abbe顯微鏡及熒光顯微鏡原理第4頁Abbe & ZeissAbbe and Zeiss developed oil immersion systems by making oils that matched the refractive index of glass. Thus they were able to make the a Numeric Aperture (N.A.) t

3、o the maximum of 1.4 allowing light microscopes to resolve two points distanced only 0.2 microns apart (the theoretical maximum resolution of visible light microscopes). Zeiss student microscope 1880顯微鏡及熒光顯微鏡原理第5頁顯微鏡及熒光顯微鏡原理第6頁19世紀，高質量消色差浸液物鏡出現，使顯微鏡觀察微細結構能力大為提升。1827年阿米奇第一個采取了浸液物鏡。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第7頁二、顯微鏡

4、基本光學原理 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第8頁Light Pathway of Microscope顯微鏡及熒光顯微鏡原理第9頁三 光學顯微鏡主要技術參數在鏡檢時，人們總是希望能清楚而明亮理想圖象，這就需要顯微鏡各項光學技術參數到達一定標準，而且要求在使用時，必須依據鏡檢目標和實際情況來協調各參數關系。只有這么，才能充分發揮顯微鏡應有性能，得到滿意鏡檢效果。 顯微鏡光學技術參數包含：數值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數并不都是越高越好，它們之間是相互聯絡又相互制約，在使用時，應依據鏡檢目標和實際情況來協調參數間關系，但應以確保分辨率為準。 顯微鏡及熒光顯微鏡原理

5、第10頁1數值孔徑數值孔徑簡寫NA，數值孔徑是物鏡和聚光鏡主要技術參數，是判斷二者（尤其對物鏡而言）性能高低主要標志。其數值大小，分別標刻在物鏡和聚光鏡外殼上。 數值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質折射率（n）和孔徑角（ ）半數正弦之乘積。用公式表示以下：NA=n sin /2顯微鏡及熒光顯微鏡原理第11頁顯微鏡及熒光顯微鏡原理第12頁孔徑角又稱“鏡口角”，是物鏡光軸上物體點與物鏡前透鏡有效直徑所形成角度。孔徑角越大，進入物鏡光通亮就越大，它與物鏡有效直徑成正比，與焦點距離成反比。 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第13頁顯微鏡及熒光顯微鏡原理第14頁Numerical Aperture/Th

6、e wider the angle the lens is capable of receiving light at, the greater its resolving powerThe higher the NA, the shorter the working distance顯微鏡及熒光顯微鏡原理第15頁顯微鏡觀察時，若想增大NA值，孔徑角是無法增大，唯一方法是增大介質折射率n值。基于這一原理，就產生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質折射率n值大于1，NA值就能大于1。 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第16頁表一、幾個介質折射率介質折射率越靠近鏡頭玻璃（ 1. 7 ）越好。sin /2最大值小于1

7、；油鏡介質為香柏油，鏡口率可靠近1.5。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第17頁2分辨率顯微鏡分辨率是指能被顯微鏡清楚區分兩個物點最小間距，又稱判別率。其計算公式是 R=0.61/NAR為最小分辨距離；為光線波長；NA為物鏡數值孔徑。可見物鏡分辨率是由物鏡NA值與照明光源波長兩個原因決定。NA值越大，照明光線波長越短，則值越小，分辨率就越高。 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第18頁/articles/formulas/formulasresolution.html顯微鏡及熒光顯微鏡原理第19頁Resolution depends on the Numerical Aperture顯微鏡及熒光顯微鏡原理第20頁R

8、esolving power. Sizes of cells and their components drawn on a logarithmic scale, indicating the range of objects that can be readily resolved by the naked eye and in the light and electron microscopes.顯微鏡及熒光顯微鏡原理第21頁要提升分辨率，即減小R值，可采取以下辦法 （1）降低波長值，使用短波長光源。 （2）增大介質n值以提升NA值 （NA=n sin a/2）。 （3）增大孔徑角a值以提

9、升NA值。 （4）增加明暗反差。 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第22頁顯微鏡及熒光顯微鏡原理第23頁顯微鏡及熒光顯微鏡原理第24頁3放大率和有效放大率 因為經過物鏡和目鏡兩次放大，所以顯微鏡總放大率應該是物鏡放大率和目鏡放大率1乘積： =1 顯然，和放大鏡相比，顯微鏡能夠含有高得多放大率，而且經過調換不一樣放大率物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡放大率。 放大率也是顯微鏡主要參數，但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率極限即有效放大倍率。 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第25頁分辨率和放大倍率是兩個不一樣但又互有聯絡概念。相關系式：500NA1000NA 當選取物鏡數值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯

10、微鏡不能分清物體微細結構，此時即使過分地增大放大倍率，得到也只能是一個輪廓雖大但細節不清圖像，稱為無效放大倍率。反之假如分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨能力，但因圖像太小而依然不能被人眼清楚視見。所認為了充分發揮顯微鏡分辨能力，應使數值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第26頁顯微鏡及熒光顯微鏡原理第27頁普通光線波長為400700nm，光鏡分辨力約為0.2m，人眼分辨力為0.2mm，所以顯微鏡最大有效倍數為1000X。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第28頁4焦深焦深為焦點深度簡稱，即在使用顯微鏡時，當焦點對準某一物體時，不但位于該點平面上各點都能夠看清楚，而

11、且在此平面上下一定厚度內，也能看得清楚，這個清楚部分厚度就是焦深。焦深大,能夠看到被檢物體全層，而焦深小，則只能看到被檢物體一薄層，焦深與其它技術參數有以下關系： （1）焦深與總放大倍數及物鏡數值孔徑成反比。 （2）焦深大，分辨率降低。 因為低倍物鏡景深較大，所以在低倍物鏡攝影時造成困難。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第29頁5視場直徑（FieldOfView） 觀察顯微鏡時，所看到明亮圓形范圍叫視場，它大小是由目鏡里視場光闌決定。 視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到圓形視場內所能容納被檢物體實際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。 增大物鏡倍數，則視場直徑減小。所以，若在低倍鏡下能夠看到被檢物體全

12、貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體很小一部份。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第30頁6覆蓋差顯微鏡光學系統也包含蓋玻片在內。因為蓋玻片厚度不標準，光線從蓋玻片進入空氣產生折射后光路發生了改變，從而產生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋差產生影響了顯微鏡成響質量。 國際上要求，蓋玻片標準厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡制造上已將此厚度范圍相差計算在內。物鏡外殼上標0.17，即表明該物鏡所要求蓋玻片厚度。 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第31頁7工作距離WD工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡表面到被檢物體之間距離。鏡檢時，被檢物體應處于物鏡一倍至二倍焦距之間。所以，它與焦距是兩個概念，平時習

13、慣所說調焦，實際上是調整工作距離。 在物鏡數值孔徑一定情況下，工作距離短孔徑角則大。 數值孔徑大高倍物鏡，其工作距離小。 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第32頁顯微鏡及熒光顯微鏡原理第33頁四 光學顯微鏡種類亮視野顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡微分干涉差顯微鏡體視顯微鏡熒光顯微鏡正置顯微鏡倒置顯微鏡、顯微鏡及熒光顯微鏡原理第34頁（一）Upright and Inverted MicroscopeImage from Nikonpromotional materials顯微鏡及熒光顯微鏡原理第35頁熒光方法是利用波長較短紫外光、紫光、藍紫光、藍光及綠光等去激發樣品，只要樣品中含有可產生熒光成份，它便吸收

14、短波激發光而釋放出波長較長熒光。（二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope顯微鏡及熒光顯微鏡原理第36頁Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green用于觀察能激發出熒光結構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診療。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第37頁顯微鏡及熒光顯微鏡原理第38頁顯微鏡及熒光顯微鏡原理第39頁特點：光源為短波光，誘導產生熒光與背景反差很大。特定物質（熒光探針）發出特定熒光，易于判別。能進行多重染色.所需熒光探針濃度低，減輕對細胞傷害，有利于活體觀察。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第40頁用途：物體結構

15、觀察熒光有沒有、色調比較進行物質判別發熒光量測定對物質定性、定量分析顯微鏡及熒光顯微鏡原理第41頁透射式熒光顯微鏡: 激發光源是經過聚光鏡穿過標本材料來激發熒光。熒光顯微鏡種類汞燈顯微鏡及熒光顯微鏡原理第42頁顯微鏡及熒光顯微鏡原理第43頁透射熒光顯微鏡原理 目鏡吸收濾色鏡 物鏡暗場聚光鏡激發濾色鏡 汞燈顯微鏡及熒光顯微鏡原理第44頁透射式熒光顯微鏡優點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數增加其熒光減弱所以對觀察較大標本材料很好。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第45頁白燈汞燈汞燈落射式熒光顯微鏡激發光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和搜集熒光物鏡。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第46頁熒光

16、顯微鏡主要部件 透射式汞燈光源激發濾色鏡暗場聚光鏡吸收濾色鏡 落射式汞燈光源激發濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡顯微鏡及熒光顯微鏡原理第47頁落射光激發熒光法（incident-light fluorescence Epi-FL） 簡稱為落射熒光法它將激發熒光用光源改在物鏡上方，光由物鏡上方經反光鏡射入物鏡去激發樣品，從樣品上被激發熒光經物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第48頁落射式熒光顯微鏡優點是視野照明均勻，成像清楚，放大倍數愈大熒光愈強。50W熒光強度比透射熒光法250W還強。顯微鏡及熒光顯微鏡原理第49頁落射式熒光顯微鏡原理顯微鏡及熒光顯微鏡原理第50頁顯微鏡及熒光顯微鏡

17、原理第51頁落射熒光顯微鏡各部件特征和作用超高壓汞燈光源:提供激發光(U、B、G) nmT%顯微鏡及熒光顯微鏡原理第52頁光源： 超高壓汞燈壽命只有200300小時燈內氣壓到達5070個大氣壓顯微鏡及熒光顯微鏡原理第53頁濾片系統包含激發濾片，吸收濾片，隔熱濾片和分光鏡。 激發濾色鏡:波長選擇BAND PASS顯微鏡及熒光顯微鏡原理第54頁 吸收濾色鏡:透過熒光,阻擋雜光 分色鏡:反射激發光,透過熒光A 透過AA 反射BB 透過B 阻擋nmnmT%T%顯微鏡及熒光顯微鏡原理第55頁落射熒光顯微鏡原理汞 燈激發濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物 鏡 標 本顯微鏡及熒光顯微鏡原理第56頁激發濾片型號允許經過

18、波長配用阻斷濾片應用UV365W410W硫代黃素熒光染色和FITCV410420W460W單胺熒光BV404435W515W、530W吖啶橙B490W515WFITC和金胺G520550W580WTRITC和佛根反應熒光染色激發濾片型號允許經過波長配用阻斷濾片應用UV365W410W硫代黃素熒光染色和FITCB490W515WFITC和金胺G520550W580WTRITC和佛根反應熒光染色激發濾片型號允許經過波長配用阻斷濾片應用UV365W410W硫代黃素熒光染色和FITCB490W515WFITC和金胺G520550W580WTRITC和佛根反應熒光染色熒光顯微鏡配套濾片 顯微鏡及熒光顯微鏡原理第57頁激發濾色鏡帶寬對圖象影響SWB: BP420-480WB: BP450-480WIB: BP460-490NB: BP470-490FITC+PI顯微鏡及熒光顯微鏡原理第58頁熒光顯微