1、神經營養素3對大鼠急性脊髓損傷后Fas表達的影響 郭樹章任先軍蔣濤歐陽忠【關鍵詞】脊髓損傷摘要：目的討論神經營養素3(NT-3)對脊髓損傷保護作用的分子機制。方法105只SD大鼠隨機分成3組：對照組(生理鹽水組)，實驗組(NT3組)，假手術組。用改良AllensD法以30g致傷SD大鼠制作大鼠全癱模型，經蛛網膜下腔導管于術后即刻、4、8、12、24h、3、7d注入NT320l(含NT-3200ng)，對照組在一樣時間點給予等容積生理鹽水，假手術組只翻開椎板后蛛網膜下腔置管，不致傷，不給藥。采用免疫組織化學方法檢測Fas蛋白在脊髓神經元的表達變化情況。結果假手術組中Fas蛋白弱陽性表達，對照組中

2、Fas蛋白4h即出現強陽性表達，24h達頂峰，實驗組與對照組相比Fas蛋白表達明顯減少(P001)。結論NT-3能通過抑制Fas蛋白的表達抑制脊髓損傷后神經元凋亡，從而保護損傷的脊髓組織，這可能是NT-3對脊髓損傷具有保護作用的機制之一。關鍵詞：神經營養素3；脊髓損傷；FasKeyrds：Neurtrphin3;Spinalrdinjury;Fas程序性細胞死亡(prgraedelldeath，PD)亦稱凋亡(apptsis)是一種自然的生理過程，在維持細胞和脊髓發育以及排除異常細胞過程中起關鍵作用。近年來凋亡在脊髓繼發性損傷中越來越受到重視。神經營養素3(NT3)對脊髓損傷有很好的保護作用，

3、已有實驗證實NT3能抑制脊髓損傷后脊髓損傷區的細胞凋亡，由于目前對BaxBl2研究較多，而對Fas研究相對較少，因此本實驗旨在通過觀察NT3對Fas蛋白表達的影響，進一步討論NT3抑制脊髓損傷后神經細胞凋亡的機制。1材料與方法11材料與儀器兔抗鼠Fas多克隆抗體(一抗)，SAB試劑盒及DAB顯色試劑盒(均購自武漢博士德公司)。NT3(YTLAB公司)，SD大鼠(第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心)。12動物與分組安康成年SD大鼠105只，體重220270g，雌雄不拘，分為3組：1NT-3組(實驗組)35只，經蛛網膜下腔分別在術后即刻、4、8、12、24h、3、7d給予NT-3溶液20l(含NT-

4、3200ng)；2生理鹽水組(對照組)35只，在一樣時間內注入等容積生理鹽水；3假手術組35只，只翻開椎板，蛛網膜下腔置管，不造成損傷。13動物模型20烏拉坦(1000gkg)腹腔麻醉，以T8為中心，取背部正中切口，顯露T712棘突及椎板，文氏鉗咬除T710棘突，咬除T8全椎板，以脊髓為中心顯露直徑約3圓形區。再咬除T10右側半椎板，暴露硬脊膜，作為蛛網膜下腔置管區。將薄銅片(約23)彎成弧形與脊髓外表形狀一致，以6g5致傷力造成大鼠T8脊髓損傷模型。大鼠尾巴痙攣性擺動，雙下肢及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓，為造模成功標志。造模成功后，用顯微鑷輕提T10處硬膜，偏離后正中血管在硬脊膜上用1l注射器

5、針頭制孔，緩慢向脊髓損傷方向于蛛網膜下腔插入細導管(內徑約01)約3，并固定于椎旁軟組織及皮膚，手術組和對照組分別在術后即刻、4、8、12、24h、3、7d給予NT-3溶液20l或等容積生理鹽水，假手術組，只翻開椎板不造成損傷，插入導管后固定縫合，不給予任何處理。術后分籠飼養，2次/d肌注青霉素，術后前3d每隔8h按摩膀胱排尿。14脊髓神經功能評價采用脊髓運動功能(BBB)評分觀察脊髓神經功能恢復情況。分別對術后24h、3、7、14d大鼠進展評分，根據大鼠晝伏夜出習性，評分均在晚上8：00進展。定量評價脊髓損傷后的運動功能。15取材及切片動物在各時間點麻醉，經左心室-主動脈插管灌流后，取出完好

6、脊髓組織。切取損傷段脊髓組織，長約5。石蠟包埋后，連續切片，片厚6。每個組織塊隨機取連續切片2張，分別做HE染色及免疫組化分析。16免疫組化石蠟切片常規脫蠟至水，免疫組化操作過程按試劑盒說明書進展,DAB顯色，鏡下控制，蒸餾水清洗終止顯色，蘇木素輕度復染，梯度脫水，透明，中性樹膠封片，進展對照觀察。應用Iage-pr-plus生物醫學圖像分析系統，在4010倍鏡下對結果進展半定量的分析，計算平均光密度值(AD值)。轉貼于論文聯盟.ll.1.7統計學處理所有數據采用spss100軟件包處理，以均數標準差(s)表示，組間差異采用獨立樣本t檢驗。P005為差異有顯著性,P001為差異非常顯著。2結果

7、21BBB評分結果BBB評分結果(表1)顯示實驗組與對照組在運動功能恢復上有顯著性差異(P001)，實驗組明顯優于對照組，說明NT-3能明顯促進大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復。表1大鼠脊髓損傷BBB評分變化實驗略22HE染色結果對照組：術后4h損傷節段灰質內可見散在的多處出血灶并可見較多神經元細胞核固縮，濃染，整個胞體及胞膜皺縮，包膜完好，呈現典型凋亡細胞形態；術后8h灰質內出血灶明顯增多，術后24h凋亡細胞數達頂峰，術后3d可見壞死細胞碎片組織，并可見膠質細胞增生，術后1損傷部位有較多增生的膠質細胞，損傷段脊髓變細，可壞死空腔，術后14d脊髓組織變得疏松，可見大量膠質細胞增生及空洞形成。實驗組

8、細胞凋亡數及空洞形成均明顯輕于對照組。在假損傷組只見少量凋亡細胞。23免疫組化結果對照組：假手術組Fas抗原免疫反響弱陽性表達，對照組：4h即出現陽性表達(圖1)，24h達頂峰(圖3)，此后表達逐漸減弱，實驗組：4h也出現陽性表達(圖2)，24h達頂峰(圖4)，但與對照組有顯著性差異(P001)(表2)表2大鼠脊髓損傷后Fas平均光密度略3討論細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是一種主動死亡方式，在生理狀態有三種主要機能：淘汰機體反響差、受損傷后不能恢復的細胞;平衡機體過度增生的各類細胞(如：炎性細胞);另外凋亡細胞不發生破裂，被吞噬細胞吞噬后不引起炎性反響，與壞死細胞被吞噬過程完全不同，故可有效限

9、制炎癥保護機體。但是在嚴重損傷時，細胞內外環境發生極度紊亂，細胞凋亡出現嚴重異常，可引起凋亡過快或延遲、凋亡比例過多或去除障礙，進而產活力體組織繼發性損傷改變1。研究脊髓損傷后神經細胞凋亡可以認識繼發性損傷機制，理解脊髓損傷后自毀過程，分析影響細胞凋亡因素，探究抑制影響因素的各種方法，改善、預防脊髓組織繼發性不良變化。線粒體途徑和死亡受體途徑是細胞凋亡的兩個根本途徑，Fas又稱AP-1，即D95,是細胞死亡受體途徑最重要的調節物質之一，它一旦于其配體結合，將會誘發細胞凋亡3。Fas與其配體FasL結合后，形成同源三聚體，通過與其效應分子Fas相關蛋白(Fas-assiatingprtEinit

10、hdeathdain，FADD)結合，形成死亡信號復合體，激活aspase-8，aspase-8激活后作用于aspase-3，后者引起染色體降解，細胞凋亡。Sakurai等4發現，兔短暫脊髓缺血后運動神經元凋亡細胞的Fas抗原在8h1d表達，推測Fas可能參與脊髓缺血后運動神經元凋亡的信號活動。本實驗研究說明脊髓損傷后4h，灰質區已出現Fas蛋白表達，傷后24h陽性細胞數量達頂峰，3d時明顯減少，14d已呈弱陽性神經元表達。實驗組4h可見Fas蛋白表達，傷后24h陽性細胞數量達頂峰，但與對照組有顯著性差異(P001)，假手術組只見少量弱陽性細胞表達，24h已根本消失。本實驗顯示Fas在傷后24

11、h達頂峰，與劉世清等5報道細胞凋亡在傷后24h達頂峰一致。在整個實驗過程中，凋亡細胞主要集中于灰質前角神經元，后角及白質的陽性細胞數均不多，其原因可能與脊髓損傷程度及血供有關。孔抗美等6研究發現中度壓迫組比重度壓迫組和輕度壓迫組的凋亡率高。當打擊作用于脊髓背側時，感覺信息的傳導障礙可以在很大程度上抑制運動信號的傳導，造成后柱區域的外傷性沖力可以引起脊髓前部同樣甚至更嚴重的損傷，同時損傷后灰質區血流供應相對較差，因此損傷較白質及后角要重，陽性細胞相對較多。同時本實驗BBB評分也說明NT-3能明顯促進大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復，那么，通過抑制Fas蛋白的表達來抑制細胞凋亡可能是NT-3對脊髓保護作用的機制之一。參考文獻：1ThpsnBApptsisinthepathgenesisandtreatentfdiseaseJSiene,1995,267：1456-14622reJ，BresnahanJ，ShuanSL，etalApptsisanddelayeddegeneratinafterspinalrdinjuryinratsandnkeysJNatureediine,1997,3：73-763RafffellsuiidefrbeginnersJNature,1998，396(6707)：119-1224