1、青天葵組培物超低溫保存研究【摘要】目的用超低溫方法保存青天葵組培物。方法采用單因子比擬法、均勻設(shè)計(jì)法考察生長(zhǎng)周齡、冷凍保護(hù)劑、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、降溫方式、化凍方式等因素對(duì)青天葵組培物超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響。結(jié)果青天葵組培物較佳的超低溫保存程序?yàn)椋褐荦g的組培物，在進(jìn)展低溫鍛煉，以為冷凍保護(hù)劑，在靜置處理，然后在，停留后投入液氮中保存，材料取出后，在化凍，無(wú)菌洗滌后，再接種，組培物可以存活并繼續(xù)生長(zhǎng)。結(jié)論超低溫保存方式可以成功保存青天葵組培物種質(zhì)資源。【關(guān)鍵詞】青天葵組培物超低溫保存Abstrat：bjetivetheNerviliafrdiiethds.Results，lnlusinNervil

2、iafrdiiKeyrds：Nerviliafrdii；青天葵別名獨(dú)葉蓮、青蓮、天葵、芋蘭等，來(lái)源于蘭科多年生宿根草本植物毛唇芋蘭Nerviliafrdii，以葉或帶塊莖的葉入藥，有清肺止咳、健脾消積、鎮(zhèn)靜止痛、清熱解毒、散結(jié)消疬之成效，主治肺癆、咳嗽咳血、瘰疬、腫毒、跌打損傷、小兒疳積、精神并口腔炎、急性咽喉炎等，對(duì)小兒肺炎有特效。由于青天葵種子無(wú)胚乳，僅靠無(wú)性繁殖，自然繁殖數(shù)量少，繁殖系數(shù)極低，資源分布極其有限。多年來(lái)，因亂采亂挖，多是連葉帶塊莖采挖加工，導(dǎo)致野生青天葵資源日益枯竭。我們已經(jīng)開(kāi)展青天葵組織培養(yǎng)及植株再生的研究工作，本研究青天葵組培物超低溫保存的影響因素，為青天葵資源再生和種

3、質(zhì)保存提供技術(shù)資料和理論根據(jù)。材料與方法材料本實(shí)驗(yàn)所用青天葵組培物是由青天葵球莖誘導(dǎo)產(chǎn)生的根狀莖。在含有的培養(yǎng)基上進(jìn)展繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度，每天光照，光照強(qiáng)度。經(jīng)不同周齡比照試驗(yàn)后，采用周齡的組培物作為超低溫保存的試驗(yàn)材料。方法冷凍保護(hù)劑考察，甘油，聚乙二醇，蔗糖，葡萄糖，水解酪蛋白種冷凍保護(hù)劑及其不同濃度配比的冷凍保護(hù)效果。預(yù)培養(yǎng)將組培物轉(zhuǎn)至含二甲基亞砜的培養(yǎng)基上，置于進(jìn)展零上低溫鍛煉。考察在此條件下預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響。冷凍程序?qū)⒔M培物放入聚乙烯塑料冷凍管中，參加預(yù)冷的保護(hù)劑，使之吞沒(méi)組培物，旋緊管塞，在靜置處理。然后將冷凍管放入，停留一定時(shí)間后投入液氮中保存。考察在溫度

4、下停留不同時(shí)間，對(duì)超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響。化凍與洗滌材料從液氮中取出化凍。考察不同的化凍方式：零上低溫，的化凍效果。待冷凍管中的冰融化后，立即參加培養(yǎng)液大量元素蔗糖，輕輕振搖，停留，傾出溶液，如此反復(fù)洗滌次。細(xì)胞生活力的檢測(cè)按簡(jiǎn)令成報(bào)道的方法：稱取洗滌后的組培物，參加氯化三苯四氮唑液，在黑暗條件下靜置染色。吸去液，用蒸餾水洗滌次。參加丙醇研磨提取被脫氫酶復(fù)原后生成的紅色甲。用型分光光度計(jì)，在處測(cè)試丙醇提取液的吸收值。用這個(gè)吸收值值表示各處理的愈傷組織經(jīng)超低溫保存后的細(xì)胞生活力。結(jié)果分析組培物生長(zhǎng)周齡對(duì)超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響細(xì)胞抗凍才能的進(jìn)步與其分裂和生長(zhǎng)活動(dòng)等生理狀態(tài)親密相關(guān)。取轉(zhuǎn)

5、移到新穎培養(yǎng)基上的組培物，考察不同的生長(zhǎng)周齡，周對(duì)組培物經(jīng)超低溫保存后的細(xì)胞生活力。結(jié)果見(jiàn)圖。圖1組培物生長(zhǎng)周齡對(duì)冷凍后細(xì)胞生活力的影響略圖2預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響略由圖知，將組培物轉(zhuǎn)移至新穎培養(yǎng)基上，開(kāi)場(chǎng)周，冷凍后細(xì)胞的值較低，說(shuō)明細(xì)胞的抗凍才能弱，培養(yǎng)至第周時(shí)，值迅速升高，細(xì)胞抗凍才能顯著增強(qiáng)，第周的值最高，此時(shí)細(xì)胞的抗凍才能最強(qiáng)，此后，隨著培養(yǎng)周齡的增加，值呈下降趨勢(shì)，細(xì)胞抗凍才能逐漸減弱。因此選擇周齡的組培物作為超低溫保存的材料是適宜的。冷凍保護(hù)劑對(duì)超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響結(jié)果見(jiàn)表。表1U121212均勻設(shè)計(jì)因子程度略按表均勻設(shè)計(jì)搭配，組合成種方案進(jìn)展試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)

6、表。表2U121212均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果略數(shù)據(jù)經(jīng)逐步回歸處理，得到方程YXX，R，F(xiàn)F，方程有顯著性意義。由方程知，和對(duì)值有顯著影響，均與值呈正相關(guān)。對(duì)方程優(yōu)化得X，X，將其代入方程，得到優(yōu)化值，按公式Y(jié)U。當(dāng)，U，計(jì)算優(yōu)化值區(qū)間估計(jì)為Y，即。按照優(yōu)化條件進(jìn)展試驗(yàn)，得到TT值為，在Y值區(qū)域內(nèi)，且比次均勻試驗(yàn)Y值都高，說(shuō)明所得結(jié)果是正確的，因此認(rèn)為是青天葵組織培養(yǎng)物較佳的冷凍保護(hù)劑。組培物預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖。圖說(shuō)明，未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的組培物，細(xì)胞TT值最低，抗凍才能較弱，預(yù)培養(yǎng)后，TT值開(kāi)場(chǎng)上升，細(xì)胞抗凍才能逐漸增強(qiáng)，到時(shí)TT值達(dá)最大，此時(shí)細(xì)胞抗凍才能最強(qiáng)，此后延長(zhǎng)預(yù)

7、培養(yǎng)時(shí)間，TT值呈下降趨勢(shì)，因此試驗(yàn)材料應(yīng)在預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)展超低溫保存。降溫方式對(duì)超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響實(shí)驗(yàn)比擬快凍法從直接投入液氮中保存和兩步冷凍法的冷凍效果，著重考察兩步法中在停留不同時(shí)間，對(duì)冷凍保存后細(xì)胞生活力的影響。結(jié)果見(jiàn)圖。圖3降溫方式對(duì)冷凍后細(xì)胞生活力的影響略圖說(shuō)明，兩步冷凍法的效果優(yōu)于快速冷凍法，采用兩步冷凍法從緩慢降溫至?xí)r，不立即投入液氮中而在此溫度下停留，冷凍后細(xì)胞生活力明顯進(jìn)步，因此降溫方式以從降溫至，停留，然后投入液氮保存。化霜凍方式對(duì)超低溫保存后細(xì)胞生活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖。圖說(shuō)明，冰箱內(nèi)化凍和以上高溫化凍的TT值較低，細(xì)胞生活力較弱，和化凍效果接近，化凍TT值最高，說(shuō)明化凍后細(xì)胞保持了較高的生活力，因此化凍是較好的化凍方式。圖4化凍方式對(duì)冷凍后細(xì)胞生活力的影響略超低溫保存后組培物的再生長(zhǎng)將化凍后的組培物，用無(wú)菌的液沖洗后，轉(zhuǎn)移至新穎培養(yǎng)基上，先黑暗培養(yǎng)周，后進(jìn)展光照培養(yǎng)，組培物可以存活，統(tǒng)計(jì)存活率為，將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基上根狀莖可以繼續(xù)生長(zhǎng)并有新