1、白花丹醌對人急性早幼粒細胞白血病細胞的體外效應【摘要】根據作者已往的臨床經歷，中草藥白花丹對急性早幼粒細胞白血病APL治療有效，但至今尚無關于白花丹對APL療效方面的系統研究。本研究的目的是通過NB4細胞體外觀察白花丹提取物白花丹醌plubagin對細胞增殖及凋亡的影響。采用TT比色法檢測白花丹醌對NB4細胞增殖抑制作用；用光學顯微鏡及透射電鏡觀察細胞形態改變；DNA凝膠電泳及annexinV/PI雙染實驗測定檢測細胞凋亡；DNAPI染色法檢測細胞亞二倍體峰及細胞周期。結果顯示:白花丹醌在2-15l/L濃度范圍內可以顯著抑制NB4細胞的增殖，且呈劑量依賴性效應關系P0.01；在光學顯微鏡及透射

2、電鏡下可見典型的細胞凋亡形態變化；白花丹醌誘導細胞出現DNA梯形條帶，annexinV/PI-凋亡細胞及亞二倍體峰，細胞周期阻滯于G2/期，凋亡細胞比例與白花丹醌呈劑量依賴性效應關系(P0.05)。結論：本研究首次證實白花丹醌可以抑制APL細胞系NB4的增殖、誘導細胞凋亡及阻滯細胞周期進程?！娟P鍵詞】白花丹醌EffetsfPlubaginntheHuanAutePryelytiLeukeiaellsInVitrAbstratArdingtpreviuslinialexperienesftheauthrs，plubagzeylaniaaseffetiveagainstautepryelytile

3、ukeia(APL).Hever，itseffetivenesshasneverbeenprvenexperientallyrunequivallylinially.Thisstudyasaiedtinvestigatetheeffetsfplubaginntheprliferatin，ellyleandapptsisfAPLelllineNB4ells.ellinhibitryrateseredetetedbyTTlrietriassay；rphlgihangeserebservedunderlightirspeandtransissineletrnirspe;apptsis-induing

4、effetseredeterinedbyDNAgeleletrphresis，annexinV/PIduble-stainedandPIsingle-stainedflytetry.Theresultsdenstratedthat2-15l/LplubagininhibitedtheprliferatinfNB4ellsinadse-dependentanner.Therphlgihangesfellapptsis，suhashrsendensatinandappttibdyfratin，erebservedbylightirspeandtransissineletrnirspe.ellyle

5、analysisshedthatNB4ellsereblkedinG2/phasefellyle.AndplubagininduedannexinV/PI-ellinreaseandDNAfragentatin.Thereasarrelatinbeteenellapptsisratesandthenentratinsfplubaginindse-dependentanner(P0.05).Itisnludedthatfrthefirsttiethepresentstudyshsthatplubaginaninhibitellprliferatin，blkellyleandindueapptsi

6、sfAPLelllineNB4ells.Keyrdsplubagin;autepryelytileukeia;NB4ell;apptsis白花丹是一種生長在我國四川、福建、臺灣、廣西、廣東等地區的常見植物，容易采獲。白花丹具有祛風散瘀、解毒殺蟲、消腫止痛等作用，用于血瘀經閉、跌打損傷、癰腫瘡毒等。白花丹醌plubagin是白花丹的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，包括抗菌消炎、抗生殖、抗凝等作用1-3。研究說明，白花丹醌可以抑制P388淋巴細胞白血并宮頸癌、肝癌等多種腫瘤細胞，是一種很有潛力的抗腫瘤藥物3-6。根據作者已往的臨床經歷，中草藥白花丹對人急性早幼粒細胞白血病APL治療有效。但迄今為

7、止尚無關于白花丹提取物白花丹醌對APL療效的研究報道。本研究旨在以NB4細胞為體外模型，初步討論白花丹提取物白花丹醌對APL細胞的增殖、細胞周期及凋亡的影響。材料和方法主要藥物及試劑白花丹醌plubagin，Lt：023K0760為美國Siga公司產品，溶解于二甲亞砜(DS)中，配成0.1l/L儲藏溶液，置于-4保存，使用時應用RPI1640培養液稀釋至工作濃度工作液中DS終濃度均小于0.1，預實驗證實對NB4細胞無影響。胎牛血清為TBD產品，annexinV/PI試劑盒購自北京寶賽生物技術。細胞系及細胞培養人APL細胞系NB4細胞為本所長期保存，培養于含10%胎牛血清、100U/l青霉素、1

8、00g/l鏈霉素的RPI1640培養液中，置37、5%2、飽和濕度的培養箱中培養，3-4天傳代1次，取對數生長期細胞進展實驗，臺盼藍染色拒染率均在95以上。NB4細胞增殖的檢測取對數生長期細胞進展實驗，以5104/l濃度將NB4細胞接種于96孔培養板star，每孔180l，置37、5%2培養箱中培養24小時后進展實驗。設不同濃度組、細胞對照組和空白對照組，每組設4-6個平行孔，繼續培養24小時或48小時，實驗終止前參加TT5g/l工作液，37孵育4小時，離心棄上清。參加100l10SDS-0.01NHl，避光過夜，酶標儀570n測吸光度A值。實驗重復3次，計算細胞生長抑制率，其公式為：生長抑制

9、率=(1-實驗組A值/對照組A值)100%。NB4細胞形態觀察白花丹醌作用NB4細胞24小時后于倒置顯微鏡下日本lypusIT-2觀察培養瓶內細胞形態。另外，收獲1107個細胞，PBS洗2次，2.5%戊二醛固定液4下固定2小時以上，1鋨酸4下固定2小時，梯度丙酮脫水，浸透，包埋，超薄切片后，鈾及鉛雙重染色，透射電鏡日本電子100X-下觀察細胞超微構造變化并攝像。凋亡細胞的DNA片段凝膠電泳收獲各組培養細胞，用常規鹽析法提取基因組DNA，2瓊脂糖電泳，紫外線光下觀察并記錄結果。細胞凋亡的annexinV-FIT/PI雙標記流式細胞術F檢測按照說明書操作，離心搜集106個細胞，用PBS洗2遍，將細

10、胞重懸于200lbingdingbuffer中，參加annexin-FIT中混勻，避光4反響30分鐘，參加PI5l，避光4反響5分鐘，參加300lbingdingbuffer，立即上流式細胞儀FASan型，美國BetnDikinsn公司檢測。實驗重復4次取均值。細胞DNA含量的DNAPI染色F測定將搜集的NB4細胞在預冷的75%乙醇中固定，-20過夜，PBS緩沖液洗去固定液，RNaseA消化，PI染色，F檢測，用隨機所附的elldifit軟件分析細胞周期。低于G1期的細胞(亞二倍體)為凋亡細胞，其占細胞總數的比例為凋亡細胞率。統計分析數據以均數標準差(xSD)表示，采用SPSS10.0軟件包處

11、理，P0.05為有顯著性差異。結果白花丹醌對NB4細胞的增殖抑制作用TT檢測顯示，白花丹醌在2-15l/L濃度范圍內對NB4細胞均有增殖抑制作用，隨著白花丹醌濃度的增加，NB4細胞活力下降，與對照組相比，差異具有顯著性P0.01表1。白花丹醌作用24小時的I50約為9l/L，48小時的I50約為5l/L。Table1.EffetsfplubaginnNB4ellprliferatin(略)白花丹醌誘導NB4細胞凋亡倒置顯微鏡觀察對照組細胞那么明顯聚集成簇，局部貼壁。白花丹醌作用后的NB4細胞數量減少，細胞大小不均，折光性減弱，細胞核固縮，細胞變分散。透射電鏡(TE)觀察局部細胞細胞器生物膜皺褶

12、起泡，胞漿中出現空泡，細胞體積縮小，細胞器致密化，核染色質濃縮邊集形成新月體，細胞膜及核膜相對完好；還有局部細胞核碎裂及凋亡小體形成(圖1)。凋亡細胞的DNA瓊脂糖電泳NB4細胞在濃度為5、10、15l/L的白花丹醌作用24小時后，在DNA瓊脂糖電泳顯示明晰的DNA梯形條帶圖2。Annexin/PI染色檢測結果白花丹醌作用NB4細胞后annexinV+PI+及annexinV+PI-細胞均增多(圖3)，說明白花丹醌細胞凋亡的作用，隨著白花丹醌濃度的增加，NB4細胞早期凋亡率遞增P0.05(表2)。Table2.Effetfplubaginnapptsisrates(%)fNB4ellsdete

13、rinedbyannexinV/PIstaining(略)白花丹醌誘導NB4細胞G2/期阻滯白花丹醌作用24小時后，NB4細胞出現亞二倍體細胞，且凋亡細胞比例與白花丹醌濃度呈劑量依賴關系P0.05；同時白花丹醌作用后G2/期細胞增多，提示白花丹醌可以影響細胞周期進程，使細胞阻滯于G2/期表3，圖4。Table3.Effetfplubaginnthedistributinsfellyleandsub-G1phase(略)討論白花丹醌是白花丹科植物白花丹PlubagzeylaniaLinn全草及枯燥根的主要有效成分1-3。白花丹醌是一種小分子萘醌化合物，為棕黃色結晶，熔點為76-78，溶于乙醇、氯

14、仿，微溶于沸水。其分子式為11H83，相對分子量為188.18，化學構造式是5-羥基-2-甲基-1，4萘醌5-hydrxy-2-ethyl-1，4-naphthquinne。研究發現，白花丹醌具有抗腫瘤、抗炎、抗細菌、抗真菌等多種作用1，2，5。白花丹醌在體外對多種腫瘤細胞系有增殖抑制作用，體內試驗也有抗腫瘤作用4-6。惡性腫瘤的發生和細胞增殖與凋亡平衡失調有關7，細胞凋亡在腫瘤生長過程中起負調控作用，可以遏制腫瘤迅速生長，人們在腫瘤治療的長期理論中，逐漸認識到可以通過誘導腫瘤細胞凋亡到達治療腫瘤的目的。本研究通過形態學檢測、膜聯蛋白染色、DNA凝膠電泳及亞二倍體檢測證實，白花丹醌可誘導NB4

15、細胞凋亡，且凋亡細胞比例與白花丹醌濃度呈依賴關系。Srinivas6等研究結果說明，白花丹醌可誘導宮頸癌細胞凋亡，其作用機制與白花丹醌增加通過胞內的活性氧物質RS含量，激活aspase-3、-9，促進凋亡誘導因子AIF釋放有關。白花丹醌誘導APL細胞凋亡的作用機制尚待進一步研究證實。細胞周期是維持細胞正常分裂增殖的重要環節，假如細胞周期的某個環節受阻，細胞生長就會受到抑制。我們的研究發現白花丹醌作用后的NB4細胞后G2/期細胞增多，這提示白花丹醌具有調控G2/期調控點的才能。Jaisal等8在小鼠胚胎纖維母細胞的研究中發現，白花丹醌通過誘導周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑DKIp21的產生，調節細胞

16、周期阻滯于S-G2/期。本研究結果顯示，白花丹醌體外可抑制細胞增殖，調控細胞周期進程及誘導細胞凋亡，有望成為APL新的輔助治療方法。本實驗僅討論了白花丹提取物白花丹醌在體外對人APL細胞系NB4細胞的影響，其在體內對細胞的影響尚有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1郭曉莊.有毒中草藥大辭典.天津：天津科技翻譯出版公司.1992：177-1792?全國中草藥匯編?編寫組.全國中草藥匯編.北京:人民衛生出版社.1975：2883LinL，YangLL，huJ.yttxinaphthquinnesandplubagiaidglusidesfrPlubagzeylania.Phytheistry，2022;6

17、2:619-6224趙鐵建，鐘振國，方卓等.白花丹水煎液對小鼠四氯化碳肝損害的影響.廣西中醫學院學報，2022;7:43-455Krishnasay，PurushthaanKK.Plubagin:astudyfitsantianer，antibaterialandantifungalprperties.IndianJExpBil，1980;18:876-8776SrinivasP，GpinathG，BanerjiA，etal.Plubagininduesreativexygenspeies，hihediateapptsisinhuanervialanerells.laring，2022;40:201-2117DeviPU，RaBS，SlnFE.Effetfplubaginntheradiatininduedytgenetiandell