1、脊髓損傷的修復與再生脊髓損傷的修復與再生第1頁脊髓損傷與修復阮懷珍 教授神經生物學教研室 Tel：753672 E-mail: hzruan61Spinal CordInjury and Regeneration脊髓損傷的修復與再生第2頁教學目標掌握:神經損傷后胞體和軸突反應 影響脊髓損傷后神經再生原因 了解:脊髓繼發性損傷機制 脊髓損傷模型制作 了解:髓損傷研究現實狀況與策略 脊髓損傷的修復與再生第3頁教學重點： 神經損傷后胞體和軸突反應 影響脊髓損傷后神經再生原因 教學難點： 脊髓繼發性損傷機制因教學對象： 碩士碩士 脊髓損傷的修復與再生第4頁使用教材：醫用神經生物學基礎，蔡文琴主編參考資

2、料：神經生物學-從神經元到腦，楊雄里等譯神經科學基礎，李繼碩主編網絡信息資源：教研室網站 49/軍隊院校網絡教學應用系統1/mta/VirClass/VMList.htm脊髓損傷的修復與再生第5頁全球不一樣國家，脊髓損傷年發病率為15/100萬-40/100萬。美國每年約有1萬例新SCI患者我國上海SCI年發生率約為13.7/100萬以上。 脊髓損傷的修復與再生第6頁脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)基礎研究主要集中在三個方面：(1）脊髓損傷后脊髓內繼發病理改變預防和逆轉。(2）脊髓損傷后功效受損但結構完整神經細胞功效恢復。(3）脊髓損傷后被離斷神經連續性重建，即脊髓再生

3、或脊髓移植。 脊髓損傷的修復與再生第7頁一、神經損傷后胞體和軸突反應二、脊髓繼發性損傷機制三、脊髓損傷模型四、試驗性脊髓損傷觀察評定方法五、影響脊髓損傷后神經再生原因六、脊髓損傷內源性保護性因子七、脊髓損傷治療策略 八、脊髓損傷修復試驗研究主要內容脊髓損傷的修復與再生第8頁受損軸突遠端發生潰變近端軸突發芽損傷區周圍膠質細胞增多巨噬細胞向損傷處遷移神經元形態、生化及代謝改變外周神經系統(PNS)和中樞神經系統（CNS）損傷后 基礎損傷反應：一、神經損傷后胞體和軸突反應脊髓損傷的修復與再生第9頁1、軸突損傷后神經元形態和功效改變胞體軸突近端軸突遠端脊髓損傷的修復與再生第10頁急性期反應特征CNS、

4、PNS相同(逆行性反應-虎斑溶解)尼氏體分散、消失*染色質溶解 chromatolysis*細胞核偏移*細胞體腫脹*突觸末梢降低（1）形態學改變脊髓損傷的修復與再生第11頁氧代謝率升高，代謝酶上調微管相關蛋白和生長相關蛋白 GAP-43和神經營養因子受體P75NTR表示增多神經肽、神經遞質以及相關酶表示改變 甘丙肽（galanin）、血管活性腸肽（VIP） P物質（SP）、神經肽Y（NPY）、膽堿乙酰化酶（2）神經元化學標志物改變脊髓損傷的修復與再生第12頁大多數軸突損傷神經元-電活動增強.再生恢復。（3）電生理學改變脊髓損傷的修復與再生第13頁多數情況下，含有共同形態、功效、投射或發育特征神

5、經元軸突損傷后有相同胞體反應2.軸突損傷后影響神經元死亡或存活原因（1）神經元類型脊髓損傷的修復與再生第14頁 相同神經元群在動物不一樣年紀段對軸突損傷反應性不相同 出生后早期幾天是運動神經元易損期AdultBaby（2）動物年紀脊髓損傷的修復與再生第15頁外周神經軸突損傷后神經元多存活，條件適宜時神經能夠再生成年動物中樞神經系統神經元軸突損傷后神經元常死亡（3）軸突延伸環境脊髓損傷的修復與再生第16頁神經軸突側支位置與數量軸突損傷部位與神經元胞體間距離（4）從損傷區到神經元胞體距離脊髓損傷的修復與再生第17頁神經元保持適宜興奮性，可促進其在軸突損傷后存活在藥品誘發低血鈉條件下，軸突切斷后幾乎

6、全部加壓素類神經元均死亡，提醒降低神經元活動性可能加重神經元對軸突損傷后神經元死亡易感性。（5）神經元興奮性脊髓損傷的修復與再生第18頁Degeneration-退行性變3.神經軸突反應軸突潰變Intact axons in PNS and CNS脊髓損傷的修復與再生第19頁軸突變性髓鞘崩解、分離脂滴球周圍細胞吞噬。Ast.Microglia,Macrophage 3-10 Days清凈Waller在距今150年前，首次發覺和統計（1）損傷遠端軸突反應瓦勒氏(Waller)變性脊髓損傷的修復與再生第20頁去除慢2w脊髓損傷的修復與再生第21頁Olig.Ast.膠質瘢痕脊髓損傷的修復與再生第22

7、頁（1）數個鞘髓郎飛氏結崩解（2）近端軸突斷端壞死，出芽，生長錐（3）吞噬細胞吞噬消化殘留壞死軸突（2）損傷近端軸突反應脊髓損傷的修復與再生第23頁神經絲(neurofilament)血影蛋白(spectrin)微管相關蛋白（MAPs）其它細胞骨架成份崩解鈣依賴性蛋白酶(calpain)軸突斷端鈣內流激活蛋白酶，將使軸突骨架去組裝（3）損傷后軸突細胞骨架改變脊髓損傷的修復與再生第24頁4. 軸突損傷反應中樞與外周差異（1）PNS雪旺氏細胞 vs CNS少突膠質細胞（2）CNS中巨噬細胞募集及去除作用不及PNS（3）CNS中小膠質細胞向吞噬細胞轉變延遲 損傷后細胞環境存在著巨大差異。 脊髓損傷的

8、修復與再生第25頁跨神經元變性周圍神經元變性僅限于受損神經元，不累及下一個神經元，而CNS受損可跨越突觸引發與之接觸下一個神經元變性。稱為跨神經元或跨突觸變性（transynaptic Degeneration ）。順行性跨神經元變性逆行性跨神經元變性損害中樞神經元軸突受損后跨神經元變性 (4) 跨神經元變性（transynaptic degeneration） 脊髓損傷的修復與再生第26頁半影區Centre Region半影區(Penumbra zone) (5)繼發性CNS損傷(Secondary injury)脊髓損傷的修復與再生第27頁 當前認為SCI后微循環和神經生化機制是脊髓繼發性

9、損傷兩大機制。 脊髓微循環調整方式:化學調整、自動調整、神經調整和神經元代謝調整二、脊髓繼發性損傷機制 脊髓損傷的修復與再生第28頁 白質血流改變與創傷程度相關。脊髓局部缺血:血管直接損傷血管活性物質釋放引發血管痙攣血管閉塞、血栓形成、血栓素A2(TXA2)和白三烯釋放1. 局部缺血脊髓損傷的修復與再生第29頁缺血、缺氧氧化磷酸化過程障礙 無氧代謝增加 PaCO2升高, PaO2及血pH值下降 ATP被耗盡Ca2+依賴性ATP酶及Na+/K+-ATP酶失活膜去極化 Ca2+內流 造成膜磷脂過氧化和花生四烯酸代謝及其產物增加組織深入缺血，血管深入痙攣。2. 基礎生化惡性循環 脊髓損傷的修復與再生

10、第30頁自由基選擇性抑制前列環素 (PGI2 )合成，使血栓素A2 (TXA2 )相對過剩。自由基對細胞膜雙磷脂結構進行過氧化作用，生成各種脂質過氧化物，損傷細胞膜，并引發溶酶體及線粒體破裂。 3.自由基大量產生 脊髓損傷的修復與再生第31頁 引發血管通透性增加和組織水腫造成微血管顯著收縮，但有時微血管反而呈麻痹性擴張 4. 單胺類物質過量釋放5. 內源性一氧化氮失活 一氧化氮（NO）含有各種生物功效，主要包含：血管舒張、神經信息傳遞和細胞毒作用。NO由SCI后大量釋放血紅蛋白及氧自由基作用而失活。 脊髓損傷的修復與再生第32頁脊髓血管通透性增加;加速了花生四烯酸代謝產物釋放;對Ca2+、自由

11、基、興奮性氨基酸進行介導或與其協同作用. 加劇了血管痙攣、血栓形成及血管內皮損害，遏制了脊髓微循環血流量。 6. 肽類物質大量釋放內源性阿片樣肽、內皮素(ET)過分釋放。7.血小板激活因子釋放增加 脊髓損傷的修復與再生第33頁 Ca2+內流是引發細胞死亡最終公共通路。 Ca2+增加能造成膜磷脂過氧化和花生四烯酸代謝增加，加重血管痙攣，引發組織水腫及缺血；凝血作用增強，加重脊髓缺血和微循環障礙。鈣離子還可阻止線粒體內電子傳遞，引發自由基釋放，以及阻止ADP向ATP轉化 8.鈣離子內流脊髓損傷的修復與再生第34頁 短期內EAA瀑布性釋放引發N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NMDA受體）過分活動，造成

12、細胞內Na+、Ca2+蓄積，進而引發組織細胞水腫并阻塞毛細血管，從而造成微循環障礙。 9.興奮性氨基酸大量增加 脊髓損傷的修復與再生第35頁理想模型應符合以下要求:1臨床相同性: 脊髓損傷模型制作過程與臨床脊髓損傷過程相近似,動物手術制備盡可能少2可調控性: 調整損傷強度3可重復性 三、脊髓損傷模型 脊髓損傷的修復與再生第36頁1閉合性挫傷模型 2開放性挫傷模型 （1）脊髓背側損傷模型： Allen于1911年首創重物墜落法。優點:與人類脊髓損傷性相近;脊髓損傷節段能夠限定,撞擊量能夠調控;硬脊膜仍完整,能夠預防外源成份侵入脊髓損傷區。（一） 急性挫傷模型脊髓損傷的修復與再生第37頁不足: 重

13、物下墜撞擊脊髓瞬間脊柱和脊髓不穩定及脊髓偏向移位,造成損傷程度就有差異。 重物墜擊脊髓未及時移開,又造成不一樣時間脊髓壓迫傷。 試驗動物種類不一樣,同一類動物之間各個體大小不一樣,造成各種動物截癱沖擊量閥值還未確定。（2） 脊髓腹側損傷模型 脊髓損傷的修復與再生第38頁 采取環套制造動物模型 （二） 切割型脊髓損傷模型 銳利刀片橫斷或半橫斷脊髓或切除一段脊髓,造成脊髓橫斷性損傷或脊髓缺損。 （三） 脊髓壓迫模型脊髓損傷的修復與再生第39頁 采取各種不一樣伎倆(如：壓迫、鉗夾、氣囊阻塞、結扎、電燒等。)阻斷主動脈、肋間動脈、腰動脈、脊髓動脈，造成脊髓缺血而產生脊髓損傷模型。 （四） 脊髓缺血模型

14、脊髓雙側皮質脊髓束纖維 （五）電解損毀模型 脊髓損傷的修復與再生第40頁脊髓損傷后動物死亡原因 創傷刺激; 失血性休克,多器官衰竭; 呼吸道、泌尿道、傷口感染; 褥瘡 脊髓損傷造模術后處理 脊髓損傷的修復與再生第41頁防治并發癥、降低死亡率辦法： 控制室溫1822,清潔籠具,盡可能單籠喂養; 預防感染:術前皮膚消毒,術中嚴格無菌操作,術后肌注青霉素3天; 術后注意保暖,皮下注射生理鹽水或葡萄糖液,以補充血容量,預防失血性休克; 天天擠壓膀胱排尿23次,直至膀胱功效恢復;肛內注開塞露,天天1次; 天天定時翻身,預防褥瘡發生。 脊髓損傷的修復與再生第42頁存在問題：試驗動物種類。臨床上大多數脊髓損

15、傷均由骨折脫位引發，不但脊髓組織發生機械變形，而且脊髓前后動脈也受損傷。制造動物模型外科技術方法差異。動物大小和體重。校準損傷裝置方法等。脊髓損傷的修復與再生第43頁四、試驗性脊髓損傷觀察評定方法 神經功效觀察組織形態學觀察神經電生理檢驗脊髓損傷的修復與再生第44頁1Gale聯合評分法(the combine behavioral score, CBS): 本法最初由Gale等所創建,只包含鼠尾拍動與熱板試驗。現經改良,已包含開放空間中運動能力分級、腳趾伸展能力分級、觸地反應能力分級、回縮反應能力、矯正反射、斜板試驗與游泳試驗等7個方面。 （一）SCI模型動物運動能力評分法脊髓損傷的修復與再生

16、第45頁2. BBB分級法(the Basso, Beattie, Bresnahanlocomotorrating scale, BBB): Tarlov法將SCI后后肢運動功效評價分為05級，用此法進行損傷脊髓功效分級評定是比較準確,但分級過于籠統,不夠精細。Basso等據此進行了改良,形成了分級為21級較為精細詳盡BBB法。 脊髓損傷的修復與再生第46頁（二）組織形態學觀察 1顯微鏡觀察：電子顯微鏡(elect ron microscope) 能夠細致地觀察神經元尼氏體、軸突、髓鞘等超微結構在SCI 前后改變,因而在SCI 研究中被廣泛應用。 2組織化學觀察 ：神經絲蛋白 、膠質纖維酸性

17、蛋白 、髓鞘堿性蛋白 、降鈣素相關基因肽 、5-羥色胺 、多巴胺-羥化酶 、酪氨酸羥化酶等。脊髓損傷的修復與再生第47頁3神經束路示蹤法：神經束路示蹤法能夠直觀看到神經纖維生長和走行,逐步成為SCI 研究不可或缺伎倆。 辣根過氧化物酶 、菜豆凝集素、麥芽凝集素 、生物素化葡聚糖胺等。脊髓損傷的修復與再生第48頁1體感誘發電位2運動誘發電位 3交感性皮膚反應 4. 肌電圖(EMG)和神經圖檢驗5反射檢驗 （三）神經電生理檢驗脊髓損傷的修復與再生第49頁1缺乏促進及引導軸突再生有效神經營養因子 2缺乏適當引導通路基質: 層粘蛋白（LN）、纖維連接蛋白（FN）和細胞表面粘附分子（CAM）等與脊髓再生

18、生長錐延長相關。 LN能降解膠質瘢痕中妨礙軸突生長蛋白多糖硫酸軟骨素五、脊髓損傷后影響神經再生原因 脊髓損傷的修復與再生第50頁 CNS再生困難成髓鞘細胞為少突膠質細胞，神經纖維無基膜包裹脊髓損傷的修復與再生第51頁？CNS vs PNS脊髓損傷的修復與再生第52頁3膠質瘢痕及空洞 脊髓損傷的修復與再生第53頁NormalGFAP+InjuryGFAP+CNS損傷部位:星形膠質細胞增生、突起相互交織最終形成膠質瘢痕，GFAP染色呈強陽性。脊髓損傷的修復與再生第54頁4存在軸突生長抑制因子髓鞘相關蛋白Myelin-Associated Glycoprotein，MAGNogo少突膠質細胞髓鞘糖蛋

19、白Oligodendrocyte-Myelin Glycoprotein，OMgp抑制性分子位于少突膠質細胞膜上脊髓損傷的修復與再生第55頁中樞神經周圍神經小膠質細胞、少突膠質細胞、星型膠質細胞雪旺細胞脊髓損傷的修復與再生第56頁CNS再生困難原因成髓鞘細胞為少突膠質細胞；神經纖維無基膜包裹；小膠質細胞去除作用較慢；膠質瘢痕形成脊髓損傷的修復與再生第57頁阻斷抑制分子：Nogo-A阻斷性抗體IN-1去除抑制分子適當細胞充填損傷神經周圍應用營養因子刺激神經元再生 促進中樞系統再生路徑：脊髓損傷的修復與再生第58頁突觸前抑制興奮性神經遞質釋放，從而降低興奮性毒性作用；調整K+和Ca2+通道，抑制神

20、經元興奮性和膠質細胞Ca2+過分內流，從而阻止細胞內Ca2+超載；使血管擴張，增加脊髓血流量，同時抑制血小板聚集，預防血栓形成。 六、脊髓損傷內源性保護性因子 （一）腺苷脊髓損傷的修復與再生第59頁 前列環素 含有很強擴血管作用，它能反抗其它幾個前列腺素(PGs) 縮血管和血小板聚集作用，因而對SCI起著一定保護作用。 （二）促甲狀腺激素釋放激素 拮抗興奮性氨基酸和血小板活化因子作用、促進損傷后Mg2+恢復、穩定細胞內外陽離子平衡、穩定磷脂、改進能量代謝等。（三）前列環素脊髓損傷的修復與再生第60頁 神經節苷脂是組成神經細胞膜雙脂層結構主要成份之一,在神經細胞分化、發育、神經組織損傷修復、神經

21、元可塑性以及突觸傳遞等方面起著極為主要作用 （四） 神經節苷脂 （五） 神經營養因子 能支持神經元存活，促進其生長、分化，維持其功效，神經元受損時可保護其存活和促進其再生一大類化學因子.脊髓損傷的修復與再生第61頁依據早期、中期和晚期3個階段病理生理改變 早期：減輕繼發性損傷造成損害：手術、采取離子通道阻滯劑、氧自由基去除劑，小膠質細胞活性物質抑制劑等治療辦法能夠減輕神經元和膠質細胞繼發性損傷； 中期；誘導損傷軸突再生，替換損失神經元，促進髓鞘再生； 晚期：經過康復訓練，恢復損傷節段以下脊髓功效。 七、脊髓損傷治療策略 脊髓損傷的修復與再生第62頁1.脊髓切開：脊髓后正中線切開減壓2.硬膜切開

22、 3.帶蒂大網膜及肌瓣轉移覆蓋 4.脊髓縫合及移植 (一)手術治療脊髓損傷的修復與再生第63頁1.高壓氧治療：采取23大氣壓高壓氧來提升損傷脊髓組織內氧張力，使組織修復并恢復神經功效。 2.局部低溫加藥品灌注：利用局部冷凍或低溫降低細胞代謝率，降低組織氧耗量，故可增強脊髓缺氧耐受性，減輕脊髓水腫，降低腦脊髓壓力；降溫還可阻止酸性物質產生。(二) 物理方法脊髓損傷的修復與再生第64頁1.類固醇:作用機制 反抗繼發炎癥反應；減輕脂質過氧化反應；抑制Ca2+細胞內蓄積,維持組織血流、氧供，抑制SCI后神經細胞凋亡。強化SCI后本身神經保護因子、營養因子、促再生因子如硫磺酸含量上升。減輕局部水腫。 (

23、三)藥品治療 3.電場治療：誘導神經纖維再生，抑制膠質細胞成熟脊髓損傷的修復與再生第65頁2.阿片受體抗抗劑 3.鈣通道阻滯劑:（1）降低或拮抗花生四烯酸活性。（2）降低血栓素-A2 生成。（3）降低自由基及其引發脂質過氧化。（4）改進脊髓血流量。 4.抗兒茶酚胺類藥品 5.抗氧化劑和自由基去除劑 脊髓損傷的修復與再生第66頁6.神經節苷脂 反抗興奮性氨基酸毒性；降低脂質過氧化反應和降低自由基形成；保護胞膜Na+-K+-ATP酶活性,預防離子失衡;預防胞內鈣蓄積;預防乳酸性酸中毒; 脊髓損傷的修復與再生第67頁直接嵌入受損神經胞膜中修復胞膜;促進各種神經生長因子作用，促進軸突和樹突發芽和再生;

24、調控各種炎性因子及其表示;抑制一氧化氮合酶活性，降低一氧化氮合成，預防一氧化氮對神經細胞損傷。 脊髓損傷的修復與再生第68頁 PN脊髓內移植能使損傷神經元發揮很大再生潛能，生長突破宿主移植物界面。同時移植PN對損傷脊髓兩端再生連接起到了一個有效橋梁作用，傳導再生軸突延伸較遠距離。 增加血液供給 雪旺氏細胞和神經營養因子作用 八、脊髓損傷修復與再生試驗研究（一）周圍神經脊髓內移植脊髓損傷的修復與再生第69頁抑制膠質瘢痕形成，降低損傷脊髓區再生軸突屏障;營養和誘導作用,促進軸突再生并重新髓鞘化;傳導作用：連接損傷脊髓兩斷端“橋狀結構”，支持并引導再生軸突穿越損傷區;代替作用：填補損傷脊髓組織缺損，

25、代替一些脊髓節段缺失神經元，發出軸突，恢復神經感覺、運動和反射功效（二）胚胎脊髓移植 脊髓損傷的修復與再生第70頁圖1單純胚胎脊髓移植組傷后4周脊髓灰質個別神經元尼氏體溶解，核固縮圖2損傷+移植+BDNF組傷后4周脊髓灰質神經元已恢復正常圖3單純脊髓損傷對照組傷后4周脊髓灰質神經元數量顯著降低，尼氏體溶解，核固縮圖4損傷+移植+NGF組傷后4周脊髓灰質神經元大個別恢復正常脊髓損傷的修復與再生第71頁1. 大鼠胚胎脊髓移植,移植后2周脊髓灰質前角BDNF免疫反應陽性細胞，2. 損傷后2周脊髓灰質前角BDNF免疫反應陽性細胞脊髓損傷的修復與再生第72頁移植后2周脊髓灰質前角NT-3免疫反應陽性細胞

26、，脊髓損傷的修復與再生第73頁V+F組神經元數目較多，排列緊密，分化很好。T-胚胎脊髓，H-受體脊髓,尼氏染色。脊髓損傷的修復與再生第74頁 FSC組界面區膠質細胞增殖，T-胚胎脊髓，H-受體脊髓,GFAP染色。脊髓損傷的修復與再生第75頁V+F組移行區缺乏顯著膠質增生，T-胚胎脊髓，H-受體脊髓,GFAP染色。脊髓損傷的修復與再生第76頁1雪旺氏細胞 SC產生NTF對神經元存活含有協同作用; 表面細胞粘附分子（CAM）與軸突生長錐表面對應分子親和性結合。 SC分泌細胞外基質（ECM）, 改變生長錐內細胞骨架成份及第二信使反應性改變，造成軸突生長延長。 （三）細胞移植脊髓損傷的修復與再生第77

27、頁2嗅球成鞘細胞移植 促進中樞神經元軸突生長，其作用強于雪旺氏細胞 脊髓損傷的修復與再生第78頁3.胚胎及神經干細胞移植 細胞移植脊髓損傷的修復與再生第79頁可能機理為: 替換缺失各種神經細胞；神經干細胞可分化成少突膠質細胞,在動物脊髓內使損傷神經軸索再髓鞘化；促進受損神經元軸索再生和神經環路重建； NSCs 分化后能夠分泌各種神經營養因子,改進脊髓微環境,同時產生各種細胞外基質,填充脊髓損傷后遺留空腔,為軸突再生提供支持物。 脊髓損傷的修復與再生第80頁干細胞增 殖遷移/分化膠質細胞路徑神經元路徑前體細胞靶點形成新髓鞘抑制瘢痕引導軸突以中間神經元組成通路調整未受損通路替換受損神經元移植干細胞誘導體內干細胞脊髓損傷的修復與再生第81頁4骨髓基質細胞移植:5活化巨噬細胞移植： 脊髓損傷的修復與再生第82頁 基因治療是指經過分子生物學技術和細胞轉移技術，將特定DNA片段轉移至特定細胞，使DNA在這些細胞中得到表示，并合成蛋白。經過基因轉移方法，能夠為脊髓損傷后神經生長提供一個適當微環境，從而使軸突再生成為可能。