1、、D380（功能基團為伯氨基）為載體戊二醒交聯固定化淀粉酶1、固定化載體的預處理吸附樹脂采用乙醇、丙酣、蒸餾水交替處理，最后用蒸館水沖洗至中 性備用；離子交換樹脂先用蒸館水漫泡脹潤、去雜，然后用HCl、NaOH交替處理，最后用蒸錮水沖洗至中性，置于4 C冰箱保存備 用。2、載體選擇取處理后載體（濕態）約1.0g，分別加入20mL酶液搖勻，在搖床上 室溫（25C攝氏度），100r/min振搖，過夜（12h），棄去上清，并以磷 酸緩沖液反復洗滌至洗滌液中無蛋白檢出。分別測定固定化酶和上清 液的酶活，并計算固定化得率。根據其酶活和得率進行篩選。3、固定化條件的優化取處理后載體（濕態）1.0g左右，加

2、入一定量戊二醒，在搖床上定溫（25C） , 100r/min振搖一定時間，棄去上清，蒸餾水反復沖洗至無 戊二醛殘留。處理后加入酶液進行固定化，條件同載體選擇。4、蛋白質含量測定采用Bradford的方法，以牛血清蛋白為標準曲線。5、酶活收率指實際測定的總的固定化酶活與固定化時所用的全部游離酶活之比。6、酶活測定以20.0mL的2%可溶性淀粉為底物，加入5.0mL的緩沖液。在60 C預熱5min后加入適量固定化酶或稀釋至適當濃度的酶液，準 確反應5min后，立即取出1.0mL反應液置于稀腆液5.0mL中搖勻 顯色。以稀腆液為空白，于660nm波長下測定其吸光度值。二、D301樹脂固定化假絲酵母脂

3、肪酶1、固定化載體及其預處理選擇7種工業應用廣泛的吸附和離子交換樹脂：D301、D113、AB-8、 D3520、D4020、D290、D280,購自南開大學化工廠。其中D301為大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂，D113為大孔弱酸性丙烯酸系 陽離子交換樹脂，AB-8、D3520和D4020為大孔吸附樹脂，D290 和D280為大孔強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂。大孔吸附樹脂： 采用乙醇、丙酮、蒸餾水交替處理，最后用蒸餾水沖洗至中性備用； 陽離子交換樹脂:將樹脂用水洗至流出清水后，用2%-4% NaOH浸泡 4-8h后用水洗至中性，再用5%鹽酸浸泡4-8h，用水洗至pH=6,待用; 陰離子交換樹

4、脂:將樹脂用水洗至流出清水后，用5%鹽酸浸泡4-8h 后,用水洗至pH=6,再用2%4%NaOH浸泡48h,用水洗至pH 7-9, 待用。2、脂肪酶的固定化采用單因素對比試驗分別進行載體選擇、5%戊二醛溶液的加入量、酶 液濃度、pH環境和反應時間等條件的優化試驗。稱取一定量脂肪酶 粉溶解于100 mL設定pH值的磷酸緩沖液中，并倒入250 mL具 塞三角燒瓶中，再加入設定量的載體，在5 C-8 C低溫冷卻液循環 泵中，攪拌器攪拌反應24h。過濾,測定上清液的蛋白質含量。抽濾分 離固體和上清液，并用同種緩沖液清洗該固定化酶，自然風干，收集后 保存待用。三、D380樹脂固定果糖基轉移酶1、樹脂的預

5、處理吸附樹脂采用乙醇、丙酣、蒸榴水交替處理，最后用蒸惰水沖洗至中 性備用;離子交換樹脂先用蒸館水浸泡脹潤、去雜，然后用4% HCl、 4% NaOH交替處理，最后用蒸館水沖洗至中性，置于4C冰箱保存 備用。2、游離果糖轉移酶提取方法黑曲霉AS0023細胞的制備見參考文獻12J。稱取一定量黑曲霉細 胞放入燒杯中，加入適量的0.05moI/ L， pH5.0的擰棱酸一磷酸 緩沖液，在冰浴環境中用超聲坡細胞破碎儀處理一定時間后，于4C 下冷凍離心(10000 * g) 20min，收集上清液在4C條件下進行超 濾以提高單位酶活，壓力0.15MPa，截留相對分子質量10000，粗 酶提取液放入冰箱保藏

6、備用。3、果糖轉移酶的固定化方法用濾紙吸干溫樹脂表面的水后稱取0.5g于三角瓶中，加入一定量的 酶液，在所需的pH下在恒溫水浴振蕩器中緩慢振蕩吸附一定時間 后，加入一定量的戊二醒進行交聯。交聯完成后，棄去上清，用緩沖 洛液沖洗戊二醒殘留及未固定上的游離酶，所得固定化酶用緩沖液漫 泡待用。4、酶活測定方法游離果糖基轉移酶活測定:一定體積底物濃度為10% (w/v )0.05moI/ L、pH5.0的擰穰酸-磷酸緩沖液于直徑50mm， 100mL的恒溫夾 套酶反應器中，50C下恒溫攪拌反應1h，于1弗水中煮沸lOmin 終止反應。5、惰組分測定方法采用HPLC(高效液相色譜)法。HPLC , Wa

7、ters 209系列，配有 R401示差折光檢測器和M740數據處理器;色譜柱：Hewlett Packard 公司 APS Hypersil 4.6 * 100mm 填料密度 5p m;流動相： 乙睛/水75/25，流速1mLl min;強度28 C;進樣量：10p L。6、酶活力定義每分鐘產生卬mol在果三糖(1-kestose )為一個酶活力單位。酶 用量為2U/g蔗糖。固定化酶活測定方法同游離果糖基轉移酶活的 測定方法。固定化酶活回收率:酶活回收率定義為固定化酶活與所添 加的總酶活的比值。四、Burkholderic cepecia 1003 產海因酶固定1、海因酶的制備將由本實驗室的

8、一株Burkholderic c叩ecia 10.03菌株發酵產酶 經過細胞破碎、硫酸鐐沉淀、疏水層析和離子交換層析等步驟后得到 經初步純化的海因酶酶液。蛋白質量濃度為1. 2mg/mL，于-2.0C 下保存備用。2、Eupergit C 和 Eupergit C 的氨基化分別稱取5 g Eupergit C和Eupergit勺颯干樹脂，于密閉容器 內，45 C下分別用4.0 mL 2.5%的NH3 H20浸泡.48 h，以去 離子水反復淋洗至中性。以pH 6.5 , 0.1 mol/L的磷酸緩沖平衡氨 基化后的樹脂，于4 C下保存備用。3、EDC溶液的配置稱取 0.785 g EDC(碳化二

9、亞膠(N 一( dimethyl-aminopropyl)- N -ethylcarbodiimide)，加入 5 mL MnC1 2 水溶液(1 mmol/L) 中，用1%HCl調節pH值至5.0，定容至12 mL。4、環氧基載體上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L的一定pH值的緩沖液稀釋，取出2mL分別加人 0.2 g的環氧基載體Eupergit C和Eupergit C濕樹脂。4C 下水平輕微振蕩后，用pH 8.5, 0.1 mol/L的Tris - HCl緩沖濾 洗，4C下至少保存48 h后方可使用。5、氨基載體上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L的一定pH值的緩沖液稀釋，取出

10、2 mL分別加 入 0.2 g 的氨基載體 Eupergit C ( -NH2)和 Eupergit 七風(-NH?) 濕樹脂，冰浴條件下手動振蕩滴加EDC溶液，4 C下懸空振蕩。反 應結束后，需用含0. 5 mol/L NaCl的pH 8.5 , 0.1 mol/L的 Tris-HCl緩沖反復淋洗3次，最后用pH 8. 5 , 0.1 moVL的Tris -HCl緩沖濾洗后4C保存。五、黑曲霉果膠酯酶固定化1、游離酶活力的測定J用pH - stat法（Z. 1. Kerte鈕，1937 ）測定果膠醋酶的活力。 取100mL質量分數為0.5%的柑桶果膠溶液于40 C下恒溫，用 O.lmol/L

11、的NaOH將pH調到4.4,加入lmL酶液（稀釋10倍）， 同時開始記時。果膠醋酶催化果膠水解，使體系的pH不斷下降，利 用自動滴定儀不斷滴人O.lmol/L的NaOH，使體系pH始終保持在 4.4。每隔lmin記1次NaOH的消耗量，反應5min ，以加人的 NaOH的微摩爾數一反應時間作圖，由所得直線的斜率計算果膠醋酶 的活力。1個酶活單位：40 C下，每分鐘生成的酸的微摩爾數，即 PE活力單位是以mol/min。2、固定化酶活力的測定J用pH - stat法（Z. 1. Kertesz ,1937）測定果膠醋酶的活力。取100mL質量分數為0.5%的柑情果膠溶液于45 C下恒溫，用 O.

12、lmol/L的NaOH將pH調到固定化果膠醋酶的最適pH（明膠固 定化果膠醋酶為4.0、蛋殼固定化果膠醋酶為4.2），加人一定量 的固定化果膠醋酶（明膠固定化果膠醋酶為8g、蛋殼固定化果膠醋 酶為1g），同時開始記時，果膠醋酶催化果膠水解，使體系的pH不 斷下降，利用自動滴定儀不斷滴人O.lmol/L的NaOH，使體系pH始 終保持在固定化果膠醋酶的最適pH。每隔lmin記1次NaOH的 消耗量，反應5min，以加人的NaOH的微摩爾數反應時間作圖，由 所得直線的斜率計算果膠醋酶的活力。1個酶活單位：45 C下，每 分鐘生成的酸的微摩爾數，即PE活力單位是以mol/min。3、固定化酶的制作方法蛋殼固定化酶的制作方法蛋殼的預處理取用水浸泡了一段時間的蛋殼，揭除內層薄膜，研成小片。用去離子 水徹底清洗后，用蒸館水洗滌，再用丙酣溶液洗滌，所得蛋殼碎片于 干燥箱內60 C干燥數小時，研成小顆粒，待用。蛋殼的酸處理稱取與預處理好的蛋殼于100mL燒杯中，向其中緩慢加人50mL pH = 1. 0的擰攘酸，以緩解蛋殼的強堿性質，擰攘酸處理24h，最終 pH =4