1、實驗十二 應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)制備染色體提前凝集標(biāo)本【實驗?zāi)康摹?通過細(xì)胞融合技術(shù)，初步了解染色體提前凝集標(biāo)本制備原理、方法及間期細(xì)胞三種時相的提前凝集染色體特點。【實驗用品】 一、材料 人宮頸癌上皮細(xì)胞(HeLa細(xì)胞) 二、器材和儀器 顯微鏡、離心機、水浴箱、熱吹風(fēng)機、10ml刻度離心管、5(1/2) 針頭注射器、試管架、染色槽、廢液缸、吸水紙、擦鏡紙、冰凍載玻片、香柏油瓶、記號筆、酒精燈。 三、試劑 50PEG、Hanks液(pH7.4)、RPMI一1640培養(yǎng)基(含10滅活小牛血清，pH7.4)10gml秋水仙素，0.075molL KCl低滲液、2檸檬酸鈉溶液、0.2次甲基蘭染液、115m

2、olL PBS、Carnoy固定液、Giemsa染液。【實驗內(nèi)容】 一、原理 如實驗十一所述，兩個或兩個以上的同種或不同種細(xì)胞可以在誘導(dǎo)物的作用下融合成一個細(xì)胞。 七十年代初，由于發(fā)現(xiàn)M期細(xì)胞內(nèi)有某種促進(jìn)染色體凝集因子，它無種屬特異性，所以在細(xì)胞融合和染色體技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了制備染色體提前凝集標(biāo)本的方法。即讓M期細(xì)胞與間期（I期）細(xì)胞融合，從而誘導(dǎo)I期細(xì)胞染色質(zhì)提前濃縮成染色體。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。這項技術(shù)已應(yīng)用于細(xì)胞周期分析、正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞染色體的微細(xì)結(jié)構(gòu)的研究、多種因素作用細(xì)胞使染色體損傷及修

3、復(fù)效應(yīng)的研究，預(yù)測某種血液病的病程、愈后及復(fù)發(fā)的臨床實踐等方面。 二、方法 1收集培養(yǎng)的M期HeLa細(xì)胞 取一瓶處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入10gml的秋水仙素使終濃度為0.04gml，在37二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12小時，使大量生長的細(xì)胞被阻斷于M期。每組取一瓶經(jīng)上述處理的細(xì)胞，以平行于細(xì)胞生長面方向反復(fù)振搖，使培養(yǎng)液不斷沖涮細(xì)胞層(或用吸管吹打)，M期細(xì)胞因變成球形容易脫離瓶壁而懸浮。將含有M期細(xì)胞的培養(yǎng)基移入離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清加人5ml Hanks液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液。 2收集培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞 取一瓶生長良好的HeLa細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基。加

4、入少量0.25的胰蛋白酶消化23分鐘，棄去胰酶消化液。然后加入5ml Hanks液。用吸管吹打成單個懸浮細(xì)胞備用。 350PEG的制備 稱取0.5g PEG(MW4,000)，倒入離心管中，在酒精燈上加熱使之融化(約為0.5ml)，再加入預(yù)熱的Hanks液0.5ml混勻，放在37水浴中待用。 4.細(xì)胞融合 (1)將上述l、2兩管細(xì)胞倒入一個離心管中充分混勻。1000rpm離心5分鐘，去掉上清，再小心地吸盡殘液。 (2)用指彈法彈散細(xì)胞，在37水浴條件下吸取0.5ml 50PEG，逐滴加入離心管內(nèi)，并不斷地輕輕搖動，整個過程約90秒鐘。然后迅速加入5ml Hanks液以終止PEG的作用。在37水

5、浴甲靜置5分鐘。 (3)1000rpm離心5分鐘。棄去上清，加入2ml有血清的RPMI一1640培養(yǎng)基，同時用針頭的注射器垂直加入10gml的秋水仙素1滴，輕輕吹打成懸液，37水浴中溫育3060分鐘。 5制備PCC標(biāo)本 細(xì)胞溫育后，1000rpm離心5分鐘棄去上清，加入10ml 0.075molL KCl低滲液輕輕制成懸液。在37處理25分鐘左右；終止時加入lml Carnoy固定液進(jìn)行固定，1000rpm離心8分鐘，去掉上清，指彈離心管底部使細(xì)胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30分鐘，1000rpm離心5分鐘，棄去上清留0.2ml，用吸管輕輕吹打成懸液，取預(yù)冷的載玻片滴一張片，烤干后，Giemsa染色15分鐘左右，水沖洗，干燥后鏡檢。 三、結(jié)果觀察 在低倍鏡下，可以容易地找到M期與I期細(xì)胞融合而誘導(dǎo)產(chǎn)生的PCC圖像，由于處于I期不同時相的細(xì)胞均能與M期細(xì)胞融合而被誘導(dǎo)產(chǎn)生PCC，因此有三種不同形態(tài)特點的提前凝集染色體：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。其形態(tài)特點分別是： G1期PCC為單線染色體，細(xì)長，著色淺呈蓬松的線團(tuán)狀；S期PCC由于染色體解旋， DNA以多點進(jìn)行復(fù)制，復(fù)制后的部分著色較深，以雙線染色體片段形式存在，故呈粉碎穎粒狀結(jié)構(gòu)；G2期PCC因DNA復(fù)制完畢，所以可見凝集的雙