1、ICS 65.020.20B05備案號：51460-2016DB32江蘇省地方標準DB32/T 3115-2016 菊花脫毒種苗生產技術規程Technology of virus-free chrysanthemum stock produce 2016 - 09 - 20 發布2016 - 11 - 20 實施江蘇省質量技術監督局發 布DB32/T 3115-2016I 目次 HYPERLINK l _bookmark0 前言II HYPERLINK l _bookmark1 1 范圍1 HYPERLINK l _bookmark2 2 規范性引用文件1 HYPERLINK l _bookm

2、ark3 3 待脫毒材料1 HYPERLINK l _bookmark4 4 脫毒處理1 HYPERLINK l _bookmark5 5 病毒檢測2 HYPERLINK l _bookmark6 6 脫毒原種苗的保存、擴繁與煉苗移栽2 HYPERLINK l _bookmark7 7 脫毒原種苗的生物性狀觀察3 HYPERLINK l _bookmark8 8 脫毒原種苗的繁殖3 HYPERLINK l _bookmark9 9 建立脫毒苗母本圃3 HYPERLINK l _bookmark10 10 脫毒種苗的質量檢測3 HYPERLINK l _bookmark11 11 包裝與貯運3

3、HYPERLINK l _bookmark12 附 錄 A （規范性附錄） RNA 病毒的反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法5 DB32/T 3115-2016II 前言本標準按GB/T 1.1-2009標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫組織編制。本標準由南京農業大學提出并歸口。 本標準起草單位：南京農業大學。 本標準主要起草人：陳素梅、管志勇、吳 丹、張 飛、房偉民、蔣甲福、陳發棣。 DB32/T 3115-2016 PAGE 7 菊花脫毒種苗生產技術規程范圍本標準規定了菊花脫毒種苗生產技術要求和規程. 本標準適用于常見菊花脫毒種苗的生產。 規范性引用文件下列文件中的條款通過

4、本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。 NY/T 1591-2008 菊花切花種苗等級規格DB32/T 1530-2009切花菊種苗生產技術規程 待脫毒材料凡有待進行脫毒處理的品種均應是通過合法途徑引進的，簽署有關品種權保護協議，或者經自主選育的、具有知識產權的品種。 脫毒處理莖尖培養脫毒無菌苗再生體系的建立經檢測含有特定病毒的菊花，取其越冬腳芽，進行外植體表面滅菌，具體步驟如下：剪除莖段上的葉片，用流動的蒸餾水沖洗15分鐘后，用濾紙吸干后，于超凈工作臺上用75%酒精浸泡30s，再轉

5、移到0.1% 升汞中洗滌35min，取出，用無菌水沖洗56次，每次不少于3min，經消毒滅菌后的菊花莖段剪成小段，每段長2-3cm，帶有12腋芽，接種于MS培養基中，每個組培瓶12個莖段。 剝取莖尖在超凈工作臺上操作，于解剖鏡下，將材料置于消毒的濾紙上，用經消毒的手術刀和解剖針逐步剝去外層葉片，切取 0.51.0mm 直徑大小的帶有 12 片葉原基的莖尖頂端組織。 分化培養將剝取的莖尖接種于經過高溫濕熱滅菌的分化培養基上，并對接種的莖尖分別編號，置于 25、光照強度 15003000lx、光照時間 16h/天的條件下培養，23 個月后可分化出新芽。 誘導生根切取 12cm 分化出的新芽接入生根

6、培養基中，在 25和光照強度 15003000lx 條件下，培養 15 20d 可長出新根。對每株生根苗進行編號。 熱處理結合莖尖培養脫毒熱處理方法將待脫毒的菊花植株放入光照培養箱中，采用變溫升溫的方式進行熱處理，在日溫/夜溫分別為26/20下培養 2d，而后每兩天晝/夜溫度分別升高 2，直至 38/30，該溫度下培養 40 d。光照時間 16 h/天，光強為 2000 lx。剝取熱處理過程長出的新梢頂端 0.30.5mm 的莖尖進行組織培養。 熱處理莖尖培養脫毒按照 4.1 莖尖培養脫毒方法進行培養，分化出苗、轉接生根，對每株生根苗進行編號。 病毒檢測主要病毒種類菊 花 B 病 毒 Chry

7、santhemum virus B （CVB) 番 茄 不 孕 病 毒 Tomato aspermy virus （TAV) 番 茄 斑 萎 病 毒 Tomato spotted wilt virus （TSWV) 黃 瓜 花 葉 病 毒 Cucumber mosaic cucumovirus （CMV) 菊 花 矮 化 類 病 毒 Chrysanthemum stunt viroid （CSVd) 菊花萎黃斑駁類病毒 Chrysanthemum chlorotic mottle viroid (CChmvd)。 檢測病毒，見附錄A。取 23cm 高的植株葉片組織作為檢測樣品，確認不帶病毒的材

8、料為脫毒原種苗，用于進一步繁殖。 脫毒原種苗的保存、擴繁與煉苗移栽脫毒原種苗保存將脫毒原種試管苗轉接到 MS 瓊脂培養基上，置于 2025的光照培養室中保存， 2030d 繼代轉接一次，繼代次數控制在 1015 代。 脫毒原種苗的擴繁調節增殖培養基中細胞分裂素和生長素濃度的比例，使增殖比控制在 2.53.5 倍之間。切取增殖后的組培不定芽，轉接至生根培養基中進行生根培養。 脫毒原種苗的煉苗移栽瓶苗株高 67cm，56 平展片，具 5 條以上 34cm 長的根時即可煉苗。煉苗以泥炭：珍珠巖（1:1, V/V）為基質，鋪于苗床或穴盤內。將組培生根苗至于光亮處鍛煉 23 天，將其從組培瓶中取出，洗去

9、根部附著的培養基，然后種植于上述苗床或穴盤內，2030 天后，每周澆 1/4 至 1/8 濃度的 MS 營養液以促進生長。溫度控制在 1525。 脫毒原種苗的生物性狀觀察隨機抽取每個無性系脫毒苗 510 株，與其母株一并種植至開花。觀察比較其主要生物性狀，與母株無差異者則可確認為原種苗，有差異則淘汰整個無性系。脫毒原種苗的繁殖組織培養繁殖按照 3.4.2 脫毒苗擴繁的方法進行。 扦插繁殖參照DB32/T 1530-2009 中的 7、8、9 執行。 建立脫毒苗母本圃保護地栽培，在防蟲溫室內作苗床栽培或地栽。土壤或基質須經蒸汽或藥劑消毒，定植前施顆粒有機肥（1kg/m2），pH 值 67，電導率

10、 0.81.2。 脫毒種苗的質量檢測脫毒種苗的質量檢測參照 NY/T 1591-2008 中 5.1.3 進行抽樣檢查，并按照 NY/T 1591-2008 中 5.2 的內容進行檢測，確定種苗的質量等級。 包裝與貯運包裝種苗袋選用材質為 0.050.08mm 的透明塑料薄膜，大小為 35cm35cm，袋上打 1216 個直徑 5mm 的透氣孔。每袋裝種苗 50100 株，袋裝時須將帶基質的根部朝下，莖葉部朝上，整齊排列，然后裝入專用種苗箱。包裝箱材質應為雙瓦楞紙箱，種苗箱應有良好的承載能力和耐濕性，寬 40cm，長 60cm，高 20cm22cm，兩側留有透氣孔。裝箱時種苗袋應直立排放，每箱

11、放置 5001000 株。裝箱后用膠帶封好箱口。 包裝標識包裝箱(圖 1)上應有明顯標識，內容包括：產品名稱、質量等級、包裝容量、生產單位、產地、采收包裝日期，若需冷藏保存，應注明冷藏溫度。標識內容要求字跡清晰、完整、規范。 圖 1 種苗包裝箱貯運可在 25冷庫中貯存，貯存時間不超過 7d。種苗運輸時間超過 3d 時，則應采用控溫 46的冷藏車。 附 錄 A（規范性附錄）RNA 病毒的反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法設備和材料槍頭、離心管和PCR 管均需經高溫消毒。A.1.1 微量移液器：2001000L、20200L、10100L、0.510L、0.52.5L、01.0L。電子天平

12、：精度為 0.01g。高速冷凍離心機。PCR 儀。水平凝膠電泳系統。凝膠成像系統。藥品和試劑所用試劑為分析純，水為滅菌的雙蒸水。A.2.1 RNA 提取試劑 Trizol，氯仿，異丙醇，70%乙醇，DEPC 水，雙蒸水。 A.2.2 反轉錄試劑 M-MLV 反轉錄酶，5M-MLV 緩沖液，核糖核酸酶抑制劑，隨機引物，10mmol/LdNTP。-20貯藏。A.2.3PCR 試劑 TaqDNA 聚合酶，10Buffer，PCR 引物（上游，下游）。A.2.4 5TBE 緩沖液 A.2.5 加樣緩沖液 0.25%溴酚藍溶解于 40%（W/V）蔗糖水溶液，4保存。 操作步驟菊花總RNA的提取菊花總 R

13、NA 的提取按照 TaKaRa 公司提供的 Trizol 試劑盒說明書進行，具體步驟包括：取菊花葉片 l00mg，用液氮研磨，加入 1mL 的 RNA 提取液，混合均勻，于冰上靜置 5 min。4，12000 g 高速離心 10 min，吸取上層溶液轉移到新的 1.5 mL 的 EP 離心管中。向離心管中加入 1/5 體積的氯仿溶液，振蕩，混合均勻，于室溫下靜置 5min。4，12000 g 高速離心 15 min，吸取上層溶液轉移到新的 1.5 mL EP 離心管中。重復步驟(3)、(4)兩次。向 1.5mL EP 管中加入等體積的異丙醇(預冷)，搖勻，室溫下靜置 10 min。4，1200

14、0g 高速離心 l0min，棄上清。用 1mL75%的乙醇洗滌 23 次，12000g 高速離心 10 min，棄上清，于超凈工作臺上通風干燥RNA，并加入 30 L 的無RNase 的DEPC 水溶解。取 2L 的RNA 加 58L 的DEPC 水稀釋，用核酸定量儀在 260/280nm 測量RNA 的濃度及純度。取 2L 的 RNA 溶液，用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的質量，其余的 RNA 放置于-80 保存備用。第一鏈 cDNA 合成cDNA 合成參照試劑盒(M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit, TaKaRa)，具體步驟如下：在離心管中配制下列混合液:

15、Total RNA (10pg-5g)1LRadom Primer (25 M)1LRNase Free dH2O4L-70保溫 10 min 后，迅速在冰上放置 2 min 以上。離心數秒，使模板RNA/引物變性溶液聚集于離心管底部。在上述 Microtube 管中配置下列反轉錄反應液： 上述模板RNA/引物變性溶液6L5M -MLV Buffer2LdNTPs Mixture (10 mM each)0.5LRNase Inhibitor (40 U/nl)0.25L RTase M-MLV (RHase H-) (200 U/L)0.4LRNase Free dH2O0.85L30保溫

16、10min。42延伸 1 h。70保溫 15 min 后冰上冷卻，得到的 cDNA 直接用于PCR 擴增，也可置于-20保存。PCR 擴增及電泳在 Microtube 管中配制下列混合液:10PCR Buffer2.5LMg2+1.5LdNTP(2.5 mM each)2.0L上游引物(20M)1.0L下游引物(20M)1.0LcDNA1.0LrTaq (5U/L)0.2LddH2Oadd to 25LPCR 反應程序：94預變性 5min；94變性 45s，按照不同病毒退火溫度不同，72延伸 1min， 35 個循環；72延伸 7min；4保溫。電泳：配制 1%-1.75%(W/V)的瓊脂糖

17、凝膠；放入電泳槽中，電泳液浸沒膠面 1 mm。樣品中加入等體積的上樣緩沖液，混勻；沿著膠孔邊緣勻速加入。接通電源，選擇合適的電壓和時間電泳。電泳結束后，膠塊置于紫外成像系統中，調整拍攝范圍和焦距，拍攝成像。結果判斷陽性對照有目標帶出現，陰性對照無帶時，檢測的效果為有效。檢測樣品有與陽性對照相同的目標帶出現時為陽性，無目標帶為陰性。 表 1菊花病毒的特異性引物病毒名稱引物序列（5-3）退火溫度產物（bp）菊花 B 病毒（CVB）P1：ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCCP2：TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT55650番茄不孕病毒（TAV）P1：CCATCCCTTCAACATCCGACTTP2：GGAGCGTTGAAGCGGAAGGAAT52499番