1、無菌檢查法目 錄一、定義與概述A二、環境B三、菌種C四、培養基D五、方法確認E六、日常無菌檢查F一、定義與概述無菌物品： 指物品中不含任何活的微生物。一、定義與概述二、環境（一）實驗環境1.環境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區域內進行（或C級下的局部A級）。2.陽性實驗室、微生物限度檢查間、無菌檢查間分離。3.嚴格按無菌操作,防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染；避免操作者自身被微生物感染。 4.無菌操作在有潔凈級別的實驗室中進行，與試驗相關的金屬器械、玻璃器皿、稀釋劑等應經過滅菌處理；其他的材料應經過表面消毒、紫外線照射消毒后，再帶入實驗室 。實驗器材滅菌器材消毒器材

2、凡是檢驗中使用的器材，能滅菌處理的，必須滅菌處理。如：玻璃器皿、吸管、培養基、稀釋劑、無菌衣、口罩等，在使用前必須經過適當方法滅菌，并在較潔凈的環境中保存備用。凡檢驗用器材無法滅菌處理的，使用前必須經消毒處理。如：無菌室的桌凳、天平、工作臺以及工作人員的手等。6二、環境二、環境（二）無菌操作基本概念：無菌操作一般是指在無菌環境條件下，使用無菌制品或無 菌器材進行檢驗或實驗的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規操作方法。操作目的：(1)保證檢驗物品不被環境中的微生物的污染； (2)防止被檢微生物在操作中污染實驗人員和實驗環境。主要方面：(1)實驗前的控制(2)檢驗過程的控制(3)意外事故的控

3、制二、環境（1）實驗前的控制1、定期檢查無菌環境的空氣是否符合規定；2、無菌室在使用前開啟紫外線燈3060min進行空氣消毒；3、在進行接種傾注瓊脂平板均需在超凈工作臺或層流罩內操作；4、檢查一切進入無菌環境的器材滅菌、消毒的標志物是否完備；5、洗手消毒：首先用肥皂涂在手上揉搓1015s，肥皂雖不殺菌，有去污作用，然后用流水徹底沖洗，可有效除去手上大多數暫住菌，如連續洗23次(視手的污染程度)，使殘余的微生物減少到最低水平，再用消毒液洗手，如新潔爾滅、乙醇等。6、操作人員將手部消毒后，先戴無菌手套，再穿戴無菌工作服(包括鞋、帽、口罩等)。嚴格的無菌服應是戴帽套頭的無扣的上衣，頸部、臉部及袖口是

4、緊口的，以保護身體，防止污染。一般的無菌衣是背開口，圍胸部、緊扣頸部與長袖緊口的，以保護身體，防止污染。7、在進入無菌室后，進行檢驗或實驗操作前應再次佩戴無菌手套，實驗過程中應用浸有消毒液的棉球或泡沫塑料物消毒手。8、檢查過程中應對環境沉降菌及手指表面微生物進行監測。二、環境（2）檢驗過程的控制1、在所有操作中均不應大幅度或快速動作，以免攪動空氣中塵埃微粒。2、使用玻璃器皿應輕取輕放，避免破損，以防培養物擴散。3、在近火焰區操作。4、使用金屬接種器具、用前、用后均需燃燒滅菌。5、用注射器吸取樣品、培養物時，注射器內應無空氣；裝卸針頭時應用滅菌的鑷子；從密封容器內抽取液體時，應注入無菌空氣；帶液

5、體的針筒針頭應向上傾斜，并用75%乙醇棉球(擠干)保護針頭根部；注射時勿用力過猛，以免內容物噴出或針頭脫落使溢出液體污染滅菌器材或環境。6、當滅菌瓶塞或試管塞掉落在工作臺上，不宜再用，應另換無菌塞，或通過火焰處理后再用。二、環境（3）意外事故的控制1、當無菌衣受污染，應脫下翻轉包裹，使污染部分包在內部，送往消毒，經滅菌后，洗滌再用。2、因偶然打破盛有培養物的器皿，致使病原性的菌種外溢，污染了工作室及操作者的衣物及體表時，首先應冷靜，切勿亂動以免擴大污染面。應喚他人用浸透消毒液的毛巾或紗布覆蓋于碎片上，或將消毒液倒在污染區，浸沒一定時間。先從外至內逐步清理污染源，最后將衣物徹底滅菌。清理時應避免

6、用手指收集玻璃碎片，以防污染皮膚，造成病原性微生物感染事故。3、對一般小面積的污染可自行處理，較大范圍的污染則請人協助。三、菌種三、菌種（一）菌種的保存保存的原則：根據微生物的菌種生理、生化特性，在人工創造的條件下盡量降低微生物細胞的代謝強度，使細胞基本上處于休眠狀態，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以降低菌種的變異率。保存步驟：保存方法：選擇典型菌落確定菌體形態選擇保藏方法定期檢查方法主要原理適用的微生物包藏時間特點瓊脂斜面低溫保藏法低溫（4）廣泛16個月簡便液體石蠟保藏法低溫，缺氧廣泛1年以上簡便干燥（砂土）保藏法干燥，無營養產孢微生物110年簡便有效冷凍真空干燥法干燥，缺氧、低溫廣泛5

7、10年復雜但有效液氮超低溫保藏法超低溫廣泛數十年復雜但有效（二）菌種的復蘇及傳代一般為凍干粉劑，安瓿瓶密封包裝。增菌性培養選擇性培養基分離菌種。斜面接種、培養保存13三、菌種注：菌株傳代次數不得超過5次。三、菌種（三）斜面接種操作方法左手持分離培養的平板培養基，右手持接種環，經火焰燒灼，冷卻后在平板上挑取菌落。左手立即放下平板，換持斜面培養基，用右手小指和無名指拔出管塞，夾持于手指之間。將管口在火焰上通過兩三次，但勿燒燙。再迅速將挑取有菌的接種環伸進斜面內，從斜面的底部向上劃一條接種線，又自下而上蜿蜒接種成曲線。退出接種環，塞上管塞。接種環經火焰滅菌后放置。培養后，沿接種線長出菌苔，非接種線的

8、部位應無細菌生長。三、菌種采用斜面保存的菌種三、菌種（四）菌液的制備四、培養基（一）實驗過程所需的培養基及稀釋液1.胰酪大豆胨液體培養基用于真菌和需氧菌的培養2.硫乙醇酸鹽流體培養基用于厭氧菌的培養，也可用于需氧菌培養3.胰酪大豆胨液體培養基用于細菌的計數4.沙氏葡萄糖瓊脂培養基用于霉菌的技術5.0.1%無菌蛋白胨水溶液6.PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液7.0.9%無菌氯化鈉溶液四、培養基（二）培養基配制 稱量調PH分裝包扎 滅菌用1N NaOH或1N HCl調pH。高壓滅菌前培養基的pH可比最終pH值調高0.2左右，滅菌后基本合適。按照生產商提供或使用者驗證的參數進行。用量筒或移液器進行分

9、裝，注意不要污染硅膠塞。標簽，注明何種培養基。四、培養基（三）培養基的貯存外購培養基 應嚴格按照供應商提供的貯存條件、 有效期和使用方法進行培養基和試劑的保 存和使用。制備好的培養基制備好的培養基應保存在225、避光的環境中，一般應在3周內使用；瓊脂平板最好現配現用，如置冰箱保存，一般不超過一周，且應密閉包裝；固體培養基滅菌后只允許一次再融化，融化后的培養基應置于4550的環境中，不得超過8小時。四、培養基（四）培養基適用性檢查無菌性檢查排除培養基本身的污染，避免無菌試驗過程中由培養基引起的假陽性。 靈敏度檢查確保培養基營養性良好，對微生物具有生長促進作用，排除無菌試驗過程中由培養基引起的假陰

10、性。注：用于無菌檢查的培養基必須經過培養基適用性檢查。四、培養基（四）培養基適用性檢查培養基培養基裝量檢查項目菌株數量菌量培養硫乙醇酸鹽流體培養基12ml靈敏度檢查金葡2100cfu/ml30353天銅綠2生孢2陰性1/無菌性檢查/5/303514天胰酪大豆胨液體培養基9ml靈敏度檢查枯草2100cfu/ml20255天白念2黑曲霉2陰性1/無菌性檢查/5/202514天四、培養基（四）培養基適用性檢查無菌性檢查結果判定 每批培養基隨機取不少于5支（瓶）置各培養基規定的溫度培養14天，應無菌生長。 靈敏度檢查結果判定空白對照管應無菌生長，若加菌的培養基管均生長良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規

11、定。五、方法確認目的：確認無菌試驗的產品是否具有抑菌性；如果有，如何去除，并被證實。 即確認供試品在該檢驗量、該檢驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可忽略不計。無菌檢查采用的方法必須與適用性試驗方法一致，確認所采用的方法適合于供試品的無菌檢查。分類：直接接種法和薄膜過濾法。五、方法確認直接接種法方法確認培養基菌株菌量供試品組別培養硫乙醇酸鹽流體培養基金葡100cfu/ml試驗組3035不超過5天金葡陽性對照組大腸試驗組大腸陽性對照組生孢試驗組生孢陽性對照組胰酪大豆胨液體培養基枯草試驗組2025不超過5天枯草陽性對照組白念試驗組白念陽性對照組黑曲霉試驗組黑曲霉陽性對照組五、方法確認薄膜

12、過濾法方法確認供試品稀釋、過濾菌株菌量培養基組別培養金葡最后一次沖洗液加菌 100cfu/ml硫乙醇酸鹽流體培養基試驗組3035不超過5天金葡陽性對照組大腸試驗組大腸陽性對照組生孢試驗組生孢陽性對照組枯草胰酪大豆胨液體培養基試驗組2025不超過5天枯草陽性對照組白念試驗組白念陽性對照組黑曲霉試驗組黑曲霉陽性對照組五、方法確認結果判斷：與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢査方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌

13、作用，應采用增加沖洗量、增加培養基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗。五、方法確認產品有抑菌性的措施：1.增加沖洗量2.增加培養基的量3.使用中和劑或滅菌劑4.更換濾膜品種注：消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗 日常進行無菌檢查陽性對照菌的選擇：無抑菌作用及抗革蘭氏陽性菌為主的供試品，選擇金黃色葡萄球菌為對照菌。六、日常無菌檢查常用實驗設備及器具：1.電子天平用于培養基干粉的稱量2.壓力蒸汽滅菌器用于培養基及實驗物品的滅菌3.恒溫培養箱用于細菌的培養4.生化培養箱用于霉菌及酵母菌的培養5.超凈工作臺用于實驗環境的提供6.生

14、物安全用于實驗環境的提供7.其他實驗材料移液器、量筒、剪刀、鑷子、無塵布、試管、與試管配套的膠塞、培養皿等六、日常無菌檢查注：檢驗量和培養基的裝量都應與方法適用性試驗方法一致。六、日常無菌檢查準備間培養基、供試品、滅菌物品的準備無菌檢查室供試品接入培養基FTM+供：N+1管TSB+供：N管陰性：FTM、TSB各1管陽性對照室取其中一支FTM+供加入小于100cfu金黃色葡萄球菌培養室FTM：3035TSB：2025培養14天，陽性培養72小時以內，逐日觀察。結果判斷陽性：生長良好陰性：無菌生長供：無菌生長無菌檢查基本流程：六、日常無菌檢查培養及觀察：六、日常無菌檢查結果判斷：陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明