1、11.2 基因工程的基本操作程序專題1 基因工程第1頁，共55頁。2第2頁，共55頁。3基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定第3頁，共55頁。4編碼區非編碼區非編碼區編碼區上游 編碼區下游 終止子啟動子與RNA聚合酶結合位點補：原核細胞的基因結構編碼區：非編碼區：編碼蛋白質，連續不間斷不編碼蛋白質，有調控作用第4頁，共55頁。5編碼區非編碼區非編碼區編碼區上游 編碼區下游 終止子啟動子與RNA聚酶結合位點補：真核細胞的基因結構外顯子內含子不編碼蛋白質，有調控作用編碼區：非編碼區：外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列第

2、5頁，共55頁。6結構基因外顯子內含子轉錄、加工修飾成熟mRNA第6頁，共55頁。7 關于內含子和外顯子的說法正確的是 （ ） A. 內含子和外顯子在轉錄的過程中都能夠轉錄成成 熟的mRNAB. 只有外顯子能夠轉錄成mRNA，tRNA，rRNAC. 原核細胞基因中也有內含子和外顯子D. 由于內含子不能編碼蛋白質，故它屬于非編碼區B第7頁，共55頁。8從基因文庫中提取目的基因1 基因文庫(gene library)概念又稱DNA文庫，是指某個生物的基因組DNA或cDNA片段與適當的載體在體外重組后，轉化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落(或噬菌體)，所有菌落或噬菌體的集合即為

3、該生物的基因文庫?；蛭膸煊赏庠碊NA片段、載體和宿主組成。第8頁，共55頁。9基因文庫的分類按照外源DNA片段的來源：從特定組織提取的染色體基因組DNA -基因組DNA文庫（總）mRNA反轉錄成的cDNA拷貝-cDNA文庫（部分）基因文庫的目的 為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。第9頁，共55頁。10基因組文庫部分基因文庫第10頁，共55頁。11基因文庫中不是直接保管相應基因，而是保存受體菌，菌中含基因第11頁，共55頁。12利用PCR提取目的基因PCR：是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。原理：DNA雙鏈復制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；

4、熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）；離子第12頁，共55頁。13模板DNA （已知堿基序列） 特異性引物（DNA）耐熱DNA聚合酶（Taq酶） dNTPs （4種脫氧核苷酸）Mg+(促進dNTP與核酸骨架作用)PCR體系基本組成成分第13頁，共55頁。14PCR的基本反應步驟變性90-95C延伸70-75C退火55-60C第三步：將反應體系升溫至7075 ，在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下，將與模板互補的單個核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA鏈延伸合成，產生一條與模板鏈互補的DNA鏈。第一步：將反應體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應所需的離子等）

5、加熱至9095 ，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為互補鏈聚合反應的模板。第二步：將反應體系降溫至5560 ，使兩種引物分別與模板DNA鏈配對結合，這個過程稱為復性。第14頁，共55頁。15模板DNA9553355335變性第15頁，共55頁。1655533555AB引物AB退火第16頁，共55頁。1772533555Taq酶延伸1第17頁，共55頁。1872533555延伸2第18頁，共55頁。19Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)溫度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20第19頁，共55頁。2

6、0729455PCR循環第20頁，共55頁。21模板DNA95第21頁，共55頁。22PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50引物1引物2DNA引物第22頁，共55頁。23PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第23頁，共55頁。24PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72第1輪結束第2輪開始第24頁，共55頁。25PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點955072TaqTaqTaqTaq第25頁，共55頁。26PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72第2輪結束第26頁，共55

7、頁。27PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點重復30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數=2n n 循環次數實際拷貝數=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環次數 第27頁，共55頁。28靶序列靶序列PCR 循環第一步：加熱變性第28頁，共55頁。29靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循環第二步：引物與靶序列退火第29頁，共55頁。30靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循環第三步：引物延伸第30頁，共55頁。31靶序列 靶序列第1個 PCR

8、循環完成后：得到兩個拷貝的靶序列第31頁，共55頁。32PCR是針對特定DNA片斷的快速體外復制增殖技術每循環一輪，目的基因的量可增加一倍增殖速率為2n,（n為循環次數） 每完成一個循環需2-4分鐘，2-3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 第32頁，共55頁。33PCR技術擴增過程a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下， 斷裂，形成 。 b、復性（55-60）：系統溫度降低，引物 與DNA模板結合，形成局部 。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物的5端3端延伸，合成與模板互補 的 。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第33頁，共55頁。34從基因文庫中獲取

9、利用PCR技術擴增利用化學方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法DNA合成儀DNA序列自動測序儀PCR擴增儀第34頁，共55頁。35基因表達載體的構建核心質粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA 連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種 限制酶 目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。第35頁，共55頁。36構建表達載體組成目的基因啟動子終止子標記基因目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在；可以遺傳給下一代；使目的基因能夠表達和發揮作用。復制原點插入基因終止子抗生素抗性基因表達載體啟動子第36頁，共55頁。37將目的基因導入植物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管

10、通道法第37頁，共55頁。38將目的基因導入動物細胞顯微注射法（將基因表達載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）第38頁，共55頁。39將目的基因導入微生物細胞Ca2處理受體細胞成為感受態細胞，再進行混合。 將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁和細胞膜的通透性。第39頁，共55頁。40目的基因的檢測與鑒定檢測:是否插入目的基因是否轉錄是否翻譯鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定第40頁，共55頁。41DNA分子雜交技術DNA-RNA分子雜交技術抗原抗體雜交技術檢驗受體細胞染色體的DNA上是否插入了目的基因檢驗目的基因是否轉錄出了mRNA檢驗目的基因是否表達出了蛋白質個體生物學檢驗個體生物學性狀觀察第41

11、頁，共55頁。42DNA附著在膜上硝化纖維素加探針報告基因（含熒光素分子）變性DNA雜交（如檢測SARS病毒等）abcd第42頁，共55頁。43檢測是否插入目的基因，利用DNA分子雜交技術，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的DNA雜交，看是否有雜交帶。檢測是否轉錄出了mRNA，利用DNA分子雜交技術，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的mRNA雜交，看是否有雜交帶。檢測目的基因是否翻譯成蛋白質?？贵w與蛋白質進行抗原抗體雜交，看是否有雜交帶。還可以進行個體水平的鑒定，根據其性狀。提示：DNA分子雜交技術首先提取受體細胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標記的DNA

12、探針雜交；抗原抗體雜交所用到的抗體是用表達出的蛋白質注射動物進行免疫，產生相應的抗體，并提取出而來的。第43頁，共55頁。44大量的受體細胞接受不多的目的基因。處理的受體細胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。 將每個受體細胞單獨培養形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產物。淘汰無表達產物的菌落，保留有表達產物的進一步培養、研究。無表達產物無表達產物有表達產物無表達產物第44頁，共55頁。45歸納: 基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法、顯微注射法目的基因的檢

13、測與鑒定檢測：是否插入、轉錄、翻譯第45頁，共55頁。461.下表關于基因工程中有關基因操作的名詞及對應的內容，正確的組合是2、下列屬于獲取目的基因的方法的是利用mRNA反轉錄形成 從基因組文庫中提取從受體細胞中提取 利用PCR技術 利用DNA轉錄 人工合成A. B. C. D.第46頁，共55頁。473.細菌的質粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細胞在自然環境中的耐藥性 B有利于對目的基因是否導入進行檢測C增加質粒分子的分子量D便于與外源基因連接4. 有關基因工程的敘述正確的是A限制酶只在獲得目的基因時才用B重組質粒的形成是在細胞內完成的C質粒都可作

14、為運載體 D蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料第47頁，共55頁。485.哪項不是基因表達載體的組成部分 A啟動子 B終止密碼 C標記基因 D目的基因6.下列哪項不是將目的基因導入植物細胞的方法 A基因槍法 B顯微注射法 C農桿菌轉化法 D花粉管通道法第48頁，共55頁。49例、采用基因工程技術將人凝血因子基因導入山羊受精卵，培育出了轉基因羊。但是，人凝血因子只存在于該轉基因羊的乳汁中。以下有關敘述，正確的是A.人體細胞中凝血因子基因編碼區的堿基對數目，等 于凝血因子氨基酸數目的3倍B.可用顯微注射技術將含有人凝血因子基因的重組 DNA分子導入羊的受精卵C.在該轉基因羊中，人凝血因子基因存在

15、于乳腺細 胞，而不存在于其他細胞中D.人凝血因子基因開始轉錄后，DNA連接酶以DNA分 子的一條鏈為模板合成mRNAB第49頁，共55頁。50 胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產量之低和價格之高可想而知。 假如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌生產出人的胰島素，想一想，如何設計？ 嘗試設計 第50頁，共55頁。511.答：不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：（1） 生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才

16、能比較有利于基因的表達；（2） 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；（3） 目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4） 為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子等；（5） 有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。思考與探究（P15）第51頁，共55頁。522.解析：農桿菌可分為根瘤農桿菌和發根農桿菌，在植物基因工程中以根瘤農桿菌的Ti質粒介導的遺傳轉化最多。根瘤農桿菌廣泛存在于雙子葉植物中。據不完全統計，約有93屬6

17、43種雙子葉植物對根瘤農桿菌敏感。裸子植物對該菌也敏感。當這些植物被該菌侵染后會誘發腫瘤。近年來，也有報道該菌對單子葉植物也有侵染能力。 根瘤農桿菌侵染植物是一個非常復雜的過程。根瘤農桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會產生一些糖類和酚類物質吸引根瘤農桿菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類誘導物為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農桿菌侵染的原因。近年來還發現一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有誘導作用。酚類物質和糖類物質既可以作為根瘤農桿菌的趨化物，又可以作為農桿菌中Ti質粒上Vir區（毒性區）基因的誘導

18、物，使Vir區基因活化，導致T-DNA的加工和轉移，從而侵染植物細胞。第52頁，共55頁。53 需要注意的是農桿菌中不同的菌株，侵染能力有差別，在基因工程中需要加以選擇使用。利用農桿菌侵染單子葉植物進行遺傳轉化時，是需要加上述酚類物質的，同時單子葉植物種類不同，農桿菌侵染進行遺傳轉化的效果也有很大差異。 如果想將一個抗病毒基因轉入小麥，也可以用農桿菌，但要注意兩點：要選擇合適的農桿菌菌株，因為不是所有的農桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；要加趨化和誘導的物質，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農桿菌的Vir區（誘導）的基因，使T-DNA轉移并插入到染色體DNA上。第53頁，共55頁。543.解析：有些蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網和高爾基復合體上加工完成的，內質網和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸