1、【爬片的準備】.爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用爬片；.應用蓋玻片，可根據自己的需要剪裁成合適的大小， 以備置于6孔板、12孔板或24孔板； 裁剪時可用前護士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪，或者是口腔科的那種小沙輪，輕輕劃一下后，稍用力一掰就分開了。如果接種大皿的話，我一般不將蓋玻片切開，直接清潔后放入培養皿中，到染色時再將之切 開，這樣既保證了細胞均一性，又可同時做幾個指標的染色。.將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時，再用三蒸水沖洗 3遍（個人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養皿中

2、烘干后進行高壓消毒。.高壓后取出放入烤箱中烤干，備用。烤干后可放入超凈臺中。.關于多聚賴氨酸，很多人都將玻片用此處理，以使細胞與玻片結合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸，細胞貼壁仍然很好，且在做后續的免疫細胞化學染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。【細胞爬片】.胰酶消化細胞后計數重懸細胞于完全培養基中。.加細胞時，根據玻片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養基，目的是使玻 片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。整個過程注意無菌操作。.根據自己的需要選擇合適的細胞密度種入培養板內即可.待細胞貼壁后，可去上清加

3、含藥培養基。.按照實驗設計，作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養皿底結合較緊，張力較大，我一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鐐子取出就可以了。如果要做諸如24h, 48h, 72h等這樣時間點的實驗的話，將所需數量的爬片取出時應用 酒精燈火焰燒一下針頭和鐐子。末取出的可接著繼續培養。【細胞爬片的固定】細胞爬片取出后，一般用 PBS洗2遍，然后再做固定。當然，根據研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因為凋亡的細胞在洗的過程中有可 能會脫落。另外在保存細胞爬片的時候， 我一般用培養皿或板，先在皿底放一層面巾紙， 然后再放爬片，

4、 這樣方便做實驗時取片。 然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標記， 為避免混淆，可用透明膠帶將 蓋子和皿連在一起。一般 -20C保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。以下為常用的固定液.冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。將純的丙酮預先放入冰箱 -20 C后便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會為固體的）細胞爬 片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20 C （丙酮有很強的揮發性，注意將含有丙酮 和爬片的器皿蓋嚴，防止其揮發）固定 10分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入 -20C保存。.多聚甲醛（常用4%）:可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細

5、胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇（CD）、主要組織相容性抗原等室溫固定15分鐘后，將表面體吹干，入 -20C保存。. 95%乙醇，可用于免疫組化。優點：穿透性強、抗原性保存較好。缺點：但醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度室溫固定15分鐘后，將表面體吹干，入 -20C保存。.甲醛（福爾馬林）應用最廣優點：形態結構保存好，且穿透性強，缺點：甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；分子間交聯形成的網格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。細

6、胞爬片IHC實驗步驟：.將已消毒的蓋玻片（需要泡酸）置于培養皿中，按 2乘104/ml的細胞密度將細胞接種于 培養皿中進行細胞爬片，爬滿后進行免疫細胞組織化學染色鑒定。.PBS清洗標本 2次各15min。.4%多聚甲醛固定 15 min。.空氣干燥 5min。.PBS清洗標本 2次各25min。.3%H2O2 孵育 15 min。. PBS清洗標本 3次 各2 min。.封閉血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。.一抗孵育（PBS配，滴度1: 200,濕盒）4度 過夜或37度60 min。陰性對照最好用一 抗來源血清，否則用 PBS液. PBS清洗標本 3次 各5 min。13二抗

7、工作液孵育（濕盒）37O度30 min。.PBS清洗標本 3次 各5 min。. C 液（濕盒） 37 度 30 min。.PBS清洗標本 3次 各5 min。.DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）約310min。.蒸儲水洗 2次1 min。.蘇木素復染 0.51min。.自來水洗 30min。.樹膠封片，觀察！有些朋友可能沒做過 細胞爬片的免疫組化染色，等做起來就會發現想的和實際的相差很遠，做爬片總是和想象中有差別，實際操作中有很多細節問題處理不好，前功盡棄。下面以我的失敗和成功經驗舉例：第一，蓋玻片需要過酸，并且自來水、蒸儲水沖洗干凈 。兩張或者以上的玻片很容易因為虹 吸作用粘到一起，很容易

8、沖不干凈，很容易把兩張完全重疊在一起的玻片當成一張，一定要看清楚。晾干片子最好是在消毒飯盒中進行，飯盒底面放上紗布，將玻片斜靠在飯盒側壁， 玻片正面不要接觸紗布，否則會粘上毛毛的。然后高壓蒸汽滅菌，烤箱中烤干。第二，爬片前最好用多聚賴氨酸或者層粘蛋白或者膠原溶液處理玻片，未處理過的細胞不容易貼壁，細胞系還好，原代細胞很少能貼得牢。這一步至關重要，否則在后面用 PBS洗片時很容易將細胞洗掉。用這些促進細胞貼壁的溶液處理玻片后，放到培養皿之前需要用培養基沖洗一到三遍！層粘蛋白和膠原還好，多聚賴氨酸有幾次我沒沖結果細胞全部不貼壁。第三，傳代消化下來的細胞一定不要過多稀釋，將濃一點的細胞懸液吹打混勻后

9、滴在玻片上，幾個小時后再追加培養基。第四，玻片在培養皿中容易漂起，如果事先在皿中鋪上液體很可能會不容易揭下來，或者揭下來時出印子在鏡下很難看。漂起的玻片很容易兩面都培養出細胞的，這時背面的細胞必須去除，挺難操作的，用 PBS沖洗可能會傷到正面的細胞，用小鐐子夾玻片很容易夾碎，也很容易脫落，小心點好。第五，將玻片拿出后一定要記好哪邊是正面，最好做玻片時將玻片切成長方形的。目前市場售的多為18mm x 18mm的蓋玻片，或者24mmx24mm的蓋玻片，正方形，很難分辨反正面， 在某個角上打個缺口， 對正方形是不中用的。可以用小砂輪切一下改成長方形，至于在某個角上用砂輪做個標記，理論上很簡單，實際操

10、作有難度。第六，上面步驟都沒問題后，玻片就需要進一步處理了，這里有幾個細節，分述如下：1.PBS對玻片是沖洗還是浸泡， 我個人認為浸泡好，我吃過沖洗的虧，每一步后都要沖洗 2-3 次，有時還沒等試驗做完，大部分細胞已經被沖掉了，呵呵！我當時欲哭無淚啊！2.4%的多聚甲醛或者別的固定液的溫度是多少，有人認為4C的好，有人認為 37的好，我個人感覺，嬌貴的原代細胞先在常溫下固定較好，然后放到4C冰箱中。我發現直接用4 C的溶液會造成細胞冷休克，從片上脫落。.用中性樹膠粘蓋玻片與載玻片時，盡量少滴樹膠，一點點就夠了，而且至少半個小時以上 才能粘牢，防止在水中脫落。否則蓋玻片就會移動，背面會出現樹膠的

11、印子，鏡下很難看， 而且擦不掉的。.固定好的片子放到冰箱中保存，我倒沒怎么試過，我基本上做好的就直接做免疫組化。 細胞爬片的抗原修復1.為什么討論抗原修復的問題？福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質分子間相互交聯形成大分子網絡， 也導致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應。因此， 抗原修復也是影響免疫組化染色結果的基本因素。. schwann細胞爬片后，我用過4%的多聚甲醛，很好。是爬片，不是石蠟切片對吧，那就不 用抗原修復了。.我做過的是血管平滑肌細胞的爬片，當時一位臨床病

12、理科的老師告訴我用70%乙醇固定，在4度固定12小時以上，做免疫組化比較好， 我做著效果還好。 關鍵是配多聚甲醛挺麻煩， 還要60度水浴才溶解，呵呵，本人就圖個簡單了。.不用抗原修復，用 1 % Triton PBS孵育可有助于暴露抗原。.我現在做的BAX和BCL-2是用丙酮固定，不需要抗原修復，可以直接做組化了 ，效果還可以. 5.細胞爬片用于免疫組化要不要脫蠟水化？要不要抗原修復啊？ ？因為細胞爬片本來就不用石蠟包埋，一般固定之后，可以凍于-20長期保存；實驗時需要水化，一般20分鐘左右；抗原修復不是必須的，因為細胞爬片要比組織切片抗原暴露好 和保存的好，所以不需要修復。但我看到過有的病理

13、老師做 Tunel時修復了一下，不過沒什么影響。個人喜好的問題。.冷丙酮固定，需要多一步tritonX100處理，以便于增加細胞的通透性。.細胞爬片的免疫組化是否需要抗原修復，如果需要應該用什么方法？另外免疫組化中應該注意什么問題？是否時間較長就容易出陽性結果？謝謝Dongwp管理員：用多聚甲醛4度固定，一般不需修復，根據需檢測的抗原和抗原所處 的部位而定，4度過夜的一抗孵育條件較易出陽性結果。Victoh版主：的確不需要。xiaodonglv0828;不需要抗原修復，抗原修復主要針對的是石蠟切片因固定劑、石蠟的制作過程對抗原的交聯或封閉作用。.要用Triton X-100做細胞穿孔的。.抗原

14、修復主要針對的是石蠟切片因固定劑、石蠟的制作過程對抗原的交聯或封閉作用。單 細胞所用的固定劑和石蠟不一樣，過程不是很繁瑣，固定時間也短，不用修復，但要充分滅活。.很多文獻都介紹用冷丙酮或乙醇固定。我比較了兩者的效果，覺得用80%的冷乙醇固定10分鐘，固定效果比較滿意。用純丙酮或乙醇固定，細胞收縮比較明顯。.直接把培養板取出，吸出培養基，然后用預熱的PBS洗三次(5min*3),就用4%的多聚甲醛固定做免疫組化，其余的步驟就沒什么特殊了！.加不加Triton是和您要染細胞的抗原分布和用途有關：Triton的作用是在細胞膜上打孔，以便抗體進入！a)如果要染抗原分布在細胞膜上面，那么就不能加Trit

15、on;b)但是如果抗原分布在胞漿或核內，那加入 Triton就顯得比較重要(雖然細胞在固定 后的通透性較活細胞大，但是還不至于讓任何東西都過去！)；c)另外作電鏡日一定不加 Triton。.DAB顯色完，不用酒精脫水，直接封片么？細胞還可以，但是組織切片的最好還是酒精脫水。這樣的觀察結果會好一些！.聚甲醛固定后，tritonx 100通透，也可以不需要抗原修復的，正如 xdb86所言在于你檢 測的抗原的要求，先不用修復，出不來再試一試！.整理過程中一些細胞爬片的小細節技巧爬片前最好用多聚賴氨酸或者層粘蛋白或者膠原溶液處理玻片，未處理過的細胞 不容易貼壁，細胞系還好，原代細胞很少能貼得牢。這一步

16、至關重要，否則在后面用PBS洗片時很容易將細胞洗掉。用這些促進細胞貼壁的溶液處理玻片后，放到培養皿之前需要用培養基沖洗一到三遍！層粘蛋白和膠原還好，多聚賴氨酸有幾次我沒沖結果細胞全部不貼壁。PBS對玻片是沖洗還是浸泡，我個人認為浸泡好，我吃過沖洗的虧4%的多聚甲醛或者別的固定液的溫度是多少，有人認為4C的好，有人認為37 C的好，我個人感覺，嬌貴的原代細胞先在常溫下固定較好，然后放到4 C冰箱中。我發現直接用4。C的溶液會造成細胞冷休克，從片上脫落。(4)染色滴加抗體時，為了節省抗體，可以先把抗體滴加在干凈的載波片上，然后玻 片的細胞面朝向抗體倒扣，同時注意防止氣泡和玻片的正反。一般 24毫米

17、的玻片只需要30-50微升抗體。當然如果操作不熟練，抗體又足夠，那就直接在玻片的細胞面上加抗體吧。.爬片的前期處理(1)取干凈的蓋玻片(剪去一角，以作為正反的標記)若干，用洗衣粉輕輕擦洗后烤干(注意輕柔，不要留下明顯痕跡，方便以后觀察細胞) 。(2)硫酸重銘酸鉀過夜。(3)取出蓋玻片后，用自來水反復沖洗20遍。(4)用一蒸水漂洗10分鐘，三蒸水沖洗 3遍。(5)晾干后泡純酒精過夜(主要是脫脂，也可用95%酒精)，用鐐子夾出(不能用手去接觸玻片，否則應重新泡酒精脫脂)，蒸儲水清洗后自然晾干(烤干容易使玻片留下水跡， 而晾干的則清新干凈)。(6)高溫高壓消毒。(7)再根據實驗要求考慮是否包被多聚賴

18、氨酸。個人的最后總結： 細胞爬片做組化不需要抗原修復，但是需要用tritonx 100通透，如果不放心的話，先不用修復，出不來結果的時候再試一試修復！ 細胞免疫熒光步驟：1.細胞爬片；首先是玻片的處理，普通的蓋玻片用砂輪劃成自己要的大小的小方塊，先用洗 衣粉洗干凈，用水沖靜烤干，然后泡酸過夜，撈酸后流水洗凈，烤干，置于器皿中高壓滅菌， 然后再烤箱中大約 8小時烤干備用。爬片可以在培養皿 六孔板或24孔板中都可，我選擇在培養皿中爬。 一為節約經費（培養皿 可以重復利用）二來覺得培養皿口大，操作比較方便。培養皿消毒同上，消毒時記得消兩把 鐐子具體操作是：用胰酶消化好細胞，充分吹打，使之成單細胞懸液

19、（注意：這一點很重要，關 系到將來爬出來片子的質量）取出消毒的培養皿，可以先加少量培養基（以使玻片與培養皿緊密接觸），將玻片小心放入擺放其中，然后將單細胞懸液一滴一滴的滴到玻片上。最后蓋上培養皿置于37度5% CO2的暖箱中培養，根據細胞生長狀況，24小時或更長時間適時取出爬片。爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒鐘，然后在4%多聚甲醛中固定 15分鐘，然后 再用37度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時操作過程中注 意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。將做好的爬片置于濾紙上晾干，然后用中性樹膠粘在載玻片上。注意一定要等中性樹膠徹底 干了之后才能做后續實驗，要不然

20、玻片會掉下來的，就又是前功盡棄了做好的細胞爬片可以放在-20保存備用，具體能保存多長時間不太清楚，當然盡量早用。2.4%多聚甲醛固定10min（固定細胞器用預冷的 70%甲醇+30%丙酮）；3.PBS 漂洗 5min；4.0.5% Triton穿孔15min（丙酮固定法不用透化處理 ）；.PBS漂洗2次，每次5min；.1%BSA 封閉 30min ;.加入1%BSA稀釋的一抗，于 37c雜交2h;.PBS漂洗2次，每次5min；.加入1%BSA稀釋的二抗，于 37c雜交1h；.PBS漂洗2次，每次5min；.5ug/ml DAPI 染色 2min；.抗淬滅封片劑封片。抗淬滅封片劑：5% DA

21、BCO （w/v）50mM Tris（pH8.0）90%甘油.細胞爬片可以用含疊氮鈉 PBS液保存.但不知道具體濃度，請告知.多謝！加在液體中作為防腐劑的疊氮鈉濃度一般為0.04-0.08%。但是我建議對于細胞爬片，還是盡量快的進行處理，以防不必要的問題！. louischen wrote:但我的細胞爬片經過 4%多聚甲醛固定，PBS沖洗后直接就放在了 20度， 還能用于免疫組化嗎？！應該沒有問題，但是還是現作先染好些，以防抗原的丟失. mRNA原位雜交經4%多聚甲醛固定，固定液需加 DEPC水。其它建議用甲醇固定。一 20 度保存.如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保

22、存兩周沒問題。時間再長就沒試過了。.丙酮中固定5-10分鐘，然后風干，放置4度保存過夜應該是沒有問題。不要固定過夜，蛋白質固定過度，會影響抗原的暴露， 影響免疫組化結果。 如果是胞漿或胞核抗原出現假陰 性結果，可考慮應用 0.5%的triton-100孵育30分鐘，滲透細胞膜。如果玻片沒有經過特殊 處理，不要用其他抗原修復的方法，會造成掉片，我曾有過這方面的體會.丙酮固定后，PBS洗滌3次，即可保存至 4度冰箱備用。. （1）細胞爬片先用 TBS洗3次，每次5分鐘4%多聚甲醛固定，室溫，20分鐘70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脫水，通風櫥內干燥，-80度保存。2周沒有問題的，我

23、保存過2個月都有信號，不過還是保存時間短一點的好.我的心肌細胞爬片用不同濃度的乙醇依次脫水后，就放在室溫中，因為是要拍電鏡，但是學校電鏡壞了，呵呵，所以放了一個月后去拍，還是很好.細胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS沖洗后，晾干，放在-20度保存一個月沒有問題的。.細胞爬片，有機溶劑如 4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，輕輕搖動玻片或培養皿等，靜 置2min左右，棄去固定液，不用PBS洗而是采用空氣干燥，干燥后的標本可于-70C長期保存。解凍時要小心抗原破壞，應先將標本轉移于干冰預冷的固定液，然后再將混合液轉移至室溫下，固定液到達室溫時取出標本，再用 PBS沖洗，在做以后的步驟。.我也做

24、過細胞爬片的組化染色，不過沒有遇到類似的問題。細胞培養好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度固定15分鐘，自然風干。室溫保存幾周內都可以用的。我想這 可能與抗原的類型有關，有的對氧化等損傷比較敏感，有的差一些。最好避光保存在4度,同時盡量隔絕空氣。免疫熒光與普通DAB顯色差別只再二抗的標記，樣品的保存應該是沒有多大差別的。.細胞爬片丙酮固定后-20度保存，現在要再做免疫熒光，將保存的爬片拿出37度復溫然后常規操作就可以了.爬片做免疫組化的優勢在于抗原新鮮，細胞形態保存較好。若爬片需長期保存并出現你這樣的問題，原因可能是：1）試驗步驟有誤，建議重復并加陽性對照片。2）加一抗前處理同石蠟切片，可

25、進行抗原修復，如胰酶消化或熱修復。3）因為抗原抗體反應在液相中進行，故對已極度干燥的爬片充分水化很重要。建議試驗前用PBS浸泡過夜。. 4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用無水酒精的，固定好后放 -20度，2-3個月是 沒有問題的。.對于一般的細胞免疫組化，我的做法是：細胞爬片用冰的純丙酮固定 20MIN ,再在通風柜將丙酮吹干，一-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白質和糖，穿透性很強，保存抗原 的免疫活性好。所以丙酮常用做細胞細胞爬片的固定劑。當然還是要根據你的實驗目的決定用那種固定劑。如：1.多聚甲醛（常用4%）:可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色。主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特

26、別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇（CD）、主要組織相容性抗原等.乙醇。優點：穿透性強、抗原性保存較好。缺點：但醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿 內蛋白質保存效果較差，使蛋白變性的作用輕， 固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度.甲醛（福爾馬林）應用最廣 優點：形態結構保存好，且穿透性強，缺點：甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液 pH降低，影響染色；分子間交聯形成的網格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。. 4度是不能保存這么長時間（1個月）的，如果抗原已被分解，再修復也沒用！.棄去固定液，不用 PBS洗而是采用空氣干

27、燥，干燥后的標本可于-70 C長期保存。.爬片置于37度PBS中洗三次，每次 3到5秒鐘，然后在4%多聚甲醛中固定15分鐘, 然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時操作過程 中注意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。將做好的爬片置于濾紙上晾干，然后用中性樹膠粘在載玻片上。注意一定要等中性樹膠徹底干了之后才能做后續實驗，要不然玻片會掉下來的，就又是前功盡棄了做好的細胞爬片可以放在-20保存備用，具體能保存多長時間不太清楚，當然盡量早用。.固定后放點PBS,然后放在4度冰箱中保存，我最長保存兩個月的，然后再做免疫組化， 應該沒有太大的問題的。.固定后4度可以存放一

28、周，-20度存放半年，我現在也要做這個，實驗室老師教的。.四度放1周應該沒問題的，你最好放在2。度，我在2。度放一個月都還出結果的.很多人作的片子很多，不可能一次作完，一個月沒問題.最佳的固定及保存方法：(1)中性緩沖福爾馬林(不必調pH):福爾馬林(40%甲醛，用時加入過量堿式MgCO3中和)10.0mlNa2HPO4.12H2o 1.9653gNaH2PO4.2H2O 0.5460g加0.85 %NaCl溶液溶解，定容至 100ml。(2)細胞固定：待細胞接近長成單層時，用鐐子取出蓋玻片， 迅速于37CPBS中漂洗2次，每次3-5秒，以清除血清。(3)將蓋玻片投入中性緩沖福爾馬林溶液中室溫

29、固定30min。(4)用鐐子取出蓋玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒，晾干保存于-20C備用。可長期保存，做實驗時，取出片子，入PBS濕潤后即可進行你的實驗。可以用于做免疫細胞化學(H.E.)或免疫熒光。(本帖沒有加分).細胞爬片固定以后要放在 -20度的冰箱.1個月內可以用. skywalkerzz wrote:過氧化氫處理這一步，用三蒸水稀釋商品濃度為 30%的過氧化氫，然后室溫下玻片放在其中浸泡10min,是不是過氧化氫導致細胞嚴重脫片？簌軟爬片應該用甲醇/雙氧水，你的細胞極可能是過氧化氫導致嚴重脫片.本人比較喜歡用4%得多聚甲醛，20分鐘很好用的。保存的時候注意片子最好晾干，不 要擠壓，防止粘片和碎裂。.細胞爬片固定好以后，如果要保存，我們的做法是倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在4度，最長半年沒問題。. 1、用新鮮配制的預冷的 4%多聚甲醛緩沖液室溫固定15 min , PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗滌3遍后是否就可以進行免疫細胞化學染