1、生物基因組序列比對分析，分子進化兔肝DNA的提取與二苯胺顯色法測定DNA含量目的基因SNP位點的鑒定及其意義綜合性設計性實驗-51此實驗共包括如下三個部分第一部分：生物基因組序列比對分析，分子進化第二部分：兔肝DNA的提取和測定第三部分：目的基因SNP位點的鑒定及其意義2第一部分：生物基因組序列比對分析、分子進化全基因組序列數據的積累,使得不同生物之間的進化關系可以從分子水平上進行研究。不同于以往單純依賴于生物形態學特征,這種分析更加深刻更加本質。利用分子序列使得我們可以研究,從單細胞生物到植物、動物甚至人的進化關系。 比較基因組學(Comparative Genomics)是基于基因組圖譜和

2、測序基礎上，對已知的基因和基因組結構進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結構上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機制，闡明物種進化關系，及基因組的內在結構。目前從模式生物基因組研究中得出一些規律：模式生物基因組一般比較小，但編碼基因的比例較高，重復順序和非編碼順序較少；其GC%比較高；內含子和外顯子的結構組織比較保守，剪切位點在多種生物中一致。3比較作圖就是利用共同的遺傳標記（主要是分子標記、基因的cDNA克隆以及基因組克隆）對相關物種進行物理或遺傳作圖，比較這些標記在不同物種基因組中的分布情況，提示染色體或染色體

3、片段上的同線性（synteny）或共線性（collinearity），從而對不同物種的基因組結構及基因組進化歷程進行精確分析。基因組比較作圖的研究，不僅提示了同屬甚至同科物種基因組間的同源性和差異性，對不同物種在起源、演化過程中的變化的研究具有巨大的啟示作用 。比較作圖的研究意義在于：一、根據不同種的基因組基因及其排列順序的高度保守特點繪制而成的比較圖，可以研究和探明它們的進化線索。廣泛的比較作圖可為多個種所用，建立它們之間的聯系框架或系統。4基因組比對軟件 MauveVISTA5一個最基本的假設是地球上所有物種都有一個共同的祖先，從這個祖先開始以數狀形式發展，通常稱為生命之樹（tree of

4、 life）。分子進化研究的目的：通過序列同源性的比較，分析序列間的變化進而了解基因的進化以及生物系統發生的內在規律。分子進化有兩個主要研究對象，以全基因組序列為研究對象分析物種進化；以某基因在多個物種的同源序列為研究對象分析基因的進化分子進化6末端物種中間枝條根末端分支節點理論上，一個DNA序列在物種形成或基因復制時，分裂成兩個子序列，因此系統發育樹一般是二歧的；如果是一棵有根樹，則樹根代表在進化歷史上是最早的、并且與其它所有分類單元都有聯系的分類單元，反映時間順序；如果找不到可以作為樹根的單元，則系統發生樹是無根樹，反映距離；從根節點出發到任何一個節點的路徑指明進化時間或者進化距離。系統發

5、生樹性質：7基因分子進化分析步驟（1）以目的基因為種子序列，搜索其在其它物種中的同源序列8（2）將上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比對，Clustal X9（3）構建系統發生樹：MEGA，PHYLIP，PAUP10（4）評價所建立的樹，分析其生物學意義11實驗目的學習從動物組織中提取DNA及其含量、純度測定的原理和方法 掌握離心機及島津UV-120的使用方法第二部分：兔肝脫氧核糖核酸（DNA）的提取和測定12利用脫氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在電解質中不同的溶解度使二者分離，在0.15M的氯化鈉溶液中脫氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在0.15M氯化鈉中溶解，因此可利用不同濃度的氯

6、化鈉溶液將核酸核蛋白、脫氧核糖核酸蛋白解離出來，而蛋白質變性沉淀，再用氯仿異丙醇抽提，將蛋白質沉淀除去，而DNA則溶解。實驗原理13實驗操作1. 棄上清留沉淀兔肝稱取4 g 加8ml 1X SSC1X SSC洗兩次取8ml勻漿液離 心勻漿、過濾2.棄上清留沉淀加至8ml 1X SSC離 心加至 8ml 0.15MNaCl-0.1MNa2EDTA離 心3.棄上清留沉淀（脫氧核糖核蛋白）14加約2倍體積95% 乙醇沉淀加 0.15MNaCl-0.1MNa2EDTA至4ml攪拌10min逐滴加入0.5ml 15% SDS加1ml5M NaCl去塞！離心加塞反復倒置抽提10min吸取上清液勿吸到中間層

7、！等體積氯仿-異丙醇混合液DNA析出用玻棒挑出挑取DNA至一離心管(小燒杯)用10ml 0.01N NaOH溶解重復一次輕攪10min15注意事項盡可能避免DNA的斷裂 1. 勻漿時應保持低溫，且勻漿時間應短； 2. 實驗中使用的吸取DNA水溶液的滴管口應粗短并成鈍口。保持DNA活性，避免酸堿或其他變性因素使DNA變性。攪動不要太大，以免使DNA斷裂。整個實驗過程應在低溫條件下進行。攪拌時動作要輕，反復倒置抽提，不可激烈振蕩。16加入15% SDS時要慢，邊攪邊滴加（兩人配合）。SDS的溫度不能太低，易凝固。吸過SDS的吸管要及時清洗。加入CHCl3/IAA液離心后，分為三層，由上到下為：無機

8、相-蛋白相-有機相。DNA溶解在無機相中，吸取無機相時動作要輕，不要吸到蛋白相。CHCl3/IAA會溶解有機玻璃，用完后不能豎直放置在試管架上，必須沖洗干凈。17離心機的使用打開電源開關；平衡放置離心管；蓋上蓋子。調節時間旋鈕至10min；緩慢調節速度旋鈕至9檔，每5-10s上升1檔；離心完畢后機器自動停止，待完全停止后，打開蓋子取出離心管。離心管必須平衡后，才能啟動離心機；離心機的蓋子必須蓋緊；離心過程中不要用重物撞擊離心機；要等離心機完全停止轉動后再打開蓋子。18二苯胺顯色法測定DNA含量DNA的-脫氧核糖在酸性條件下轉變成-羥基-r酮基戊醛，與二苯胺共熱后形成藍色化合物，該化合物在595

9、nm處最大吸收。每ml含20400g范圍內光密度與DNA的濃度成正比。反應液中加入少量乙醛，可提高反應的靈敏度。實驗原理19取8支試管，按實驗指導的表格加入試劑。加畢置沸水浴10分鐘，取出冷卻；以0號管（空白管）調零點，于595nm波長比色。以光密度為縱坐標，DNA含量（g/ml）為橫坐標，繪制標準曲線.將實驗中所得到的兔肝DNA溶液作為待測樣品，取兩只試管，分別標“U”和“B”，按表加入試劑。混勻，置沸水中10min, 取出冷卻。在595nm處，以B管調零，測得待測液的光密度值，從標準曲線上查出相當于該光密度值DNA的含量。實驗操作20核酸在220-320nm處呈特征性吸收，在260nm處有

10、最大吸收，測A260/A280可得知核酸的大致純度。 A260/A280 1.8 表示DNA純 1.8 RNA含量高 1.8 蛋白含量高核酸紫外吸收光譜的測定21雙波長分光光度計，該種機采用兩個光源，可在可見光和紫外區對物質進行分析，鎢絲燈發出光的適宜范圍在3601000nm，氘燈發出光的適宜范圍在150400nm。 通過兩種光源的切換，可以在兩種波長范圍內使用。使用石英杯作為比色杯。島津UV-120分光光度計22打開電源，指示燈亮，調至UV，打開樣品室蓋打開氘燈（向下按至Heat幾秒后扳至ON）預熱10min調節波長、靈敏度旋扭調至“0-100%T”，放入空白管與樣品，調0% T蓋上蓋子，旋

11、扭調至“ABS 0-2”，調0% A 拉出樣品，讀數。開蓋，記錄。島津UV-120使用方法23以0.01N NaOH 為空白管，在260nm和280nm波長處測定樣品液的吸光度，求出樣品液的A260/A280比值和DNA濃度。實驗操作24第三部分：目的基因SNP位點的鑒定及其意義SNP(single nucleotide polymophism) 即單核苷酸多態，是指群體中變異頻率大于1 %的單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態，包括置換、顛換、缺失和插入。一般來說，一個 SNP 位點只有兩種等位基因，因此又叫雙等位基因。SNP在人基因組中的發生頻率比較高，大約平均每1000個堿基中就有一個多態

12、位點。C C A T T G A C.G G T A A C T G.C C G T T G A C.G G C A A C T G.25SNP對基因功能影響根據在基因中的位置，SNP 可分為基因編碼區SNP(coding SNP, cSNP)、基因內含子區SNP和基因調控區SNP(regulatory SNP, rSNP)。其中cSNP根據是否改變編碼的氨基酸又可分為同義cSNP (synonymous cSNP)和非同義cSNP (non-synonymous cSNP)。非同義cSNP：，蛋白激酶PRKCH基因內的一個非同義cSNP(1425G/A)，等位位點從G到A 的改變可導致激酶的

13、活力增強，進而激活其信號通路，使患腦梗塞的風險增加。同義cSNP：多向性耐藥基因1(MDR1)第3435 位的一個同義SNP(3435C/T)可改變MDR1 基因產物的功能。這種機制不是通過改變mRNA 及蛋白的產量水平，而是通過改變mRNA 的構象、蛋白的折疊及細胞定位，進而影響基因功能的發揮。內含子區SNP：葡萄糖激酶調節蛋白(GCKR)基因第16 號內含子中的一個SNP(rs780094, T/C)，相比C等位位點，含T等位位點時，個體表現為葡萄糖水平較低、胰島素耐受較少，患2型糖尿病的風險較低。調控區rSNP：IFN-基因啟動子區含一個rSNP(-764G/C)，相比C 等位位點，含G 等位位點時，IFN-g 基因啟動子與轉錄因子的結合增強，啟動子活力提高到23倍。26目的基因SNP的查詢27輸入