1、第 PAGE 7頁共 NUMPAGES 7頁田蘭 女 本科 主管藥師 研究方向食品藥品衛生檢驗 E-mail：第 PAGE 1頁共 NUMPAGES 7頁高效液相色譜-二極管陣列法測定發酵面制品中合成著色劑 田蘭，包綜方，張繼春,陳睿，儲忠英，范晶（上海市松江食品藥品檢驗所 上海 201600）摘要 目的 建立高效液相色譜-二極管陣列法同時測定發酵面制品中的檸檬黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和亮藍5種合成色素的方法。方法 采用Kromasil C18色譜柱(250mm4.6 mm,10m)。以甲醇+乙腈（1+1）和乙酸銨溶液（0.01mol/L ，pH=4.0）為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL

2、/min，用二極管陣列檢測器記錄各個色譜峰的紫外吸收光譜，色譜檢測波長254 nm。結果：各色素在1.56g/mL50.0g/mL質量濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數均為1.0000。將該方法用于實際樣品的檢測，5種人工合成色素的加標回收率在98.9%101.6%之間，相對標準偏差為0.11%0.41%。結論：該方法操作簡便、靈敏、結果可靠。關鍵詞：高效液相色譜-二極管陣列法；發酵面制品；合成著色劑；食品安全Simultaneous Determination of Synthetic Colorants in Fermentation products by High- performa

3、nce Liquid Chromatographic-diode Array DetectorTIAN Lan，BAO Zong-fang，ZHANG Ji-chun，CHEN Rui，CHU ZHong-ying，Fan Jing (Shanghai Songjiang Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201600 China)Abstract Objective A high performance liquid chromatographic-diode array detector was developed for the

4、simultaneous determination of Lemon Yellow, Carmine, Sunset Yellow, Allura Red and Bright Blue in Fermentation products. Methods The separation was performed on a Kromasil C18(250mm4.6mm,10m) with methanol+acetonitrile （1+1） and ammonium acetate （0.01mol/L ，pH=4.0）as the mobile phase and the flow ra

5、te was 1.0 mL/min. , The detection wavelength was 254 nm and the UV spectra of peaks were obtained by a photodiode array detector (DAD). Results The method showed good linearity , the linear ranges were 1.56g/mL50.0g/mL(r=1.0000). The average recoveries of colorants ranged from 98.9%101.6%, with RSD

6、s of 0.11%0.41%. Conclusion The method is simple，accurate，sensitive and reliable.keyword：high performance liquid chromatographic-diode array detector, Fermentation products, synthetic colorants；food safety 目前針對食品中合成著色劑的檢測方法有國標、高效液相色譜法等方法，這些色譜條件待測組份出峰時間太早，不適宜檢測發酵面制品這種含淀粉比較多且粘稠的樣品，如果樣品不進行特殊的前處理并改變色譜條件

7、，將會影響檢測結果。因此建立準確、高效的分析方法用于發酵面制品中合成色素的準確測定具有重要意義。1實驗部分1.1儀器及試劑1.1.1儀器Agilent 1100型高效液相色譜儀，Kromasil C18色譜柱(2504.6 mm,10m)，HP-1100系列四元泵，二極管陣列檢測器，自動進樣器，色譜柱恒溫裝置。 1.1.2標準物質 檸檬黃（GBW(E)100001a）、胭脂紅（GBW(E)100004a）、日落黃（GBW(E)100003a）、亮藍（GBW(E)100005a）均購自中國計量科學研究院,濃度均為0.500 mg/mL誘惑紅(GBW(E)100002a天津市衛生防病中心研制，濃度

8、為1.00 mg/mL)1.1.3試劑 甲醇（色譜純）、乙醇、乙酸銨、檸檬酸、甲酸和氨水（均為分析純），聚酰胺粉（100200目）、水為超純水（電阻率18.2Mcm）。1.2標準溶液的配制 精密吸取檸檬黃、胭脂紅、日落黃、亮藍標準品溶液（0.500 mg/mL）各10.00 mL和誘惑紅標準溶液（1.00mg/mL）5.00mL于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，得質量濃度為50.0g/mL的混合色素標準儲備液。1.3實驗方法1.3.1樣品來源及前處理 選取市場中銷售發酵面制品,包括玉米饅頭、黃金糕、青團等。1.3.2 樣品前處理 分別稱取粉碎均勻的樣品約1.0000g10.0000g

9、,加入無水乙醇+氨水+水（7+2+1）溶液30mL ,超聲5min，用脫脂棉漏斗過濾，用15mL無水乙醇+氨水+水（7+2+1）溶液分3次清洗濾渣。收集洗脫液，置水浴上蒸發至近干，加超純水10mL，用檸檬酸溶液(20g/100mL)調節pH值到4為試樣溶液，備用。1.3.3 色素的提取 按GB/T5009.35-20031進行, 取試樣溶液加熱至60，將1.0g2.0g聚酰胺粉加少許pH=4的水調成粥狀，倒入試樣溶液中,攪拌均勻,以G3垂融漏斗抽濾，用pH=4的水(60)洗滌4次,然后用甲醇+甲酸（6+4）混合溶液洗滌3次5次，每次10mL，再用水洗至中性。用乙醇+氨水+水溶液解吸4次6次，每

10、次10mL。收集洗脫液,蒸發到近干,用超純水定容至10.00ml,經0.45m濾膜過濾，棄去初濾液，取續濾液進高效液相色譜系統測定。1.4色譜條件1.4.1檢測波長的選擇 通過對各色素的波長掃描，找到各色素主要吸收波長，將不同色素吸收波長進行對比，在254nm下5種合成著色劑都存在著吸收峰（見圖（1），故確定本組的最佳測定波長為254nm。結合二級管陣列檢測器的聯用,可對被分離組分在全波長范圍內掃描獲得其吸收光譜。圖（1）是二級管陣列檢測器在線采集的檸檬黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和亮藍5種合成色素的吸收光譜,在200 nm700 nm范圍內5種合成色素均有最大吸收波長和特征吸收峰。在測定中，將

11、流動相（甲醇+乙腈（1+1）+乙酸銨（0.01mol/L ，pH=4.0）按不同比例混合，得到最佳分析條件，在這些條件下，各著色劑分離完全，靈敏度高，出峰時間較短，分析速度快。圖1 5種色素標準品的光譜圖Fig.1 Spectra of five colorants standards1.檸檬黃,2. 胭脂紅,3.日落黃,4. 誘惑紅,5. 亮藍1. Lemon Yellow,2. Carmine,3. Sunset Yellow,4. Allura Red,5. Bright Blue1.4.2色譜條件 色譜柱: Kromasil C18 (250 mm4.6mm,10m)； 柱溫：35；流

12、速:1.0mL/min；進樣量：10L；二極管陣列檢測波長254nm,DAD采集波長光譜檢測范圍為200nm700nm。流動相為:A相：乙酸銨溶液（0.01 mol/L ，pH=4.0）, B相：甲醇+乙腈（1+1）；梯度洗脫程序為：0 min4min B相13保持，4 min14 min B相1335，14 min21 min B相3598，21 min27 min B相98。 2.方法學考察2.1線性關系將50mg/mL的混合色素標準儲備液稀釋成質量濃度分別為1.56g/mL、3.12g/mL、6.25g/mL、12.5g/mL、25.0g/mL、50.0g/mL的系列標準工作溶液，按優化

13、色譜條件測定并繪制標準曲線，結果表明5種合成色素在1.56g/mL50.0g/mL的范圍內具有良好的線性關系，線性相關系數均為1.0000。2.2 精密度試驗：精密稱取粉碎均勻的玉米饅頭1.0000g，在100g/mL加標水平下平行檢測6次，檸檬黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和亮藍相對標準偏差分別為0.16%、0.12%、0.11%、0.16%和0.41%,方法顯示了較好的精密度。2.3穩定性試驗：取精密度試驗下的試樣溶液（試樣：玉米饅頭），測定6次，每次間隔4h，測得峰面積積分值，檸檬黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和亮藍相對標準偏差分別為 0.10%、 0.15%、0.15%、0.10%和0.53%

14、;表明試樣溶液中5種合成色素在24h內穩定。2.4重現性試驗：取同一樣品(玉米饅頭)，按檢測方法重復進行6次試驗，檢出檸檬黃平均含量為0.1942 g/kg,RSD為0.82%，胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍均未檢出，證明此方法重現性良好。2.5加標回收率準確稱取1.0000g玉米饅頭樣品9份,在25.0g、100g、250g每個加標水平加三份下,每個量各平行檢測3次，計算加標回收率和相對標準偏差，結果見表1。可以看出：5種色素的平均回收率為98.9%101.6%，相對標準偏差不大于4.00%。表1 樣品加混標時各色素的回收率及精密度（n=9） Table1 Recoveries and RSD

15、s of five synthetic colorants from spkied sample (n=9) 色素名 稱樣量（g） 加入量g 測定值g 回收率（%） 平均回收率(%) RSD(%) 檸檬黃 0.8929，0.8935,0.8953 25.0 198.2082，198.4284,198.5992 99.23,99.64,98.93 lemon yellow 0.8954,0.8975,0.8953 100 274.3622,273.2319,274.7887 100.48,99.94,100.92 100.3 0.93 0.8992,0.9101,0.9227 250 429.4

16、653,428.7116,430.4099 101.94,100.79,100.49 胭脂紅 0.8929，0.8935,0.8953 25.0 24.9651,24.9972,25.0509 99.97,99.99,100.20carmine 0.8954,0.8975,0.8953 100 99.9125,99.7314,100.2062 99.91,99.73,100.21 100.4 0.67 0.8992,0.9101,0.9227 250 253.1837,253.0524,253.6543 101.27,101.22,101.46 日落黃 0.8929，0.8935,0.8953

17、 25.0 25.0372,25.0575,24.9988 100.15,100.23,100.00 sunset yellow 0.8954,0.8975,0.8953 100 100.2827,99.8260,100.1516 100.28,99.83,100.15 100.5 0.640.8992,0.9101,0.9227 250 252.6428,252.5040,254.5159 101.06,101.00,101.81 誘惑紅 0.8929，0.8935,0.8953 25.0 25.1714,25.1577,24.9973 100.69,100.63,99.99 allura

18、red 0.8954,0.8975,0.8953 100 102.4535,102.0585,102.6965 102.45,102.06,102.70 101.6 0.98 0.8992,0.9101,0.9227 250 256.2677,255.8894,253.5271 102.51,102.36,101.41 亮 藍 0.8929，0.8935,0.8953 25.0 24.0258,24.3260,22.8607 96.10, 97.30, 91.44 bright blue 0.8954,0.8975,0.8953 100 100.2961,99.1085,100.4779 10

19、0.30,99.11,100.48 98.9 3.47 0.8992,0.9101,0.9227 250 253.5395,252.8859,256.0003 101.42,101.15,102.40 2.6定性確證對于基質比較復雜的樣品,盡管采用有效的前處理方法，仍會出現發酵面制品中的未知成分干擾待測組分測定的情況，若僅以保留時間對組分定性會受到色譜儀狀態、色譜柱狀態、流動相組成微小變化等因素的影響,從而影響檢測結果的準確性。二級管陣列檢測器的使用,得到被測組分的光譜信息,是保留時間定性的一種補充2。圖2是玉米饅頭樣品的色譜分離圖譜,可以看出在保留時間4.406min出現了1個色譜峰,與4.

20、400min檸檬黃標準品的保留時間吻合（圖3）,初步判斷該處是檸檬黃。為排除假陽性,考察由二極管陣列檢測器在線采集到的吸收光譜,圖4為玉米包頭中4.406min峰與4.400min檸檬黃標準品吸收光譜的重疊,可以看出,樣品中色譜峰4.406min的吸收光譜與4.400min檸檬黃標準品吸收光譜吻合,并結合二極管陣列檢測器得出的匹配度和峰純度，從而可以確證樣品中含有檸檬黃色素，避免出現假陽性的結果。圖2 試樣溶液高效液相色譜圖Fig.2 chromatorams of sample圖3 5種合成色素標準品高效液相色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of five synth

21、etic colorants standards1. Lemon Yellow,2. Carmine,3. Sunset Yellow,4. Allura Red,5. Bright Blue圖4 試樣與檸檬黃標準品吸收光譜Fig.4 Spectra of sample and Lemon Yellow standard2.7最低檢出限以3倍基線噪聲所相當檸檬黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍的量計算檢出限,結果分別為0.21ng、0.69ng、0.21ng、0.81ng、0.81ng。2.8最低定量限 以10倍基線噪聲所相當于檸檬黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍的量計算最低定量限,本方法最低定

22、量限分別為0.70ng、2.3ng、0.70ng、2.7ng、2.7ng。2.9干擾試驗在此條件下對標準品溶液、試樣溶液及同法制備的空白溶液進行測定，試樣溶液色譜圖中在與標準品溶液相同位置具有吸收峰，空白溶液結果則為陰性（見圖5），且標準品測定無干擾。同時為檢查常用食品添加劑對本實驗的干擾，在此色譜條件下，分別對50.0g/mL苯甲酸、山梨酸、糖精鈉混合標準品溶液和5種合成色素與苯甲酸、山梨酸、糖精鈉混合標準品進行進樣，均不干擾上述5種合成色素出峰。（見圖6）圖5 空白高效液相色譜圖Fig.5 chromatograms of bank圖6 5種合成色素與苯甲酸、山梨酸、糖精鈉混合標準品高效液

23、相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of five synthetic colorants and Benzoic Acid、Sorbic Acid、Saccharin Sodium mixed standard1. 糖精鈉,2.苯甲酸,3. 山梨酸1. Saccharin Sodium,2. Benzoic Acid,3. Sorbic Acid2.10樣品的測定分別取不同廠家生產的玉米饅頭、青團、高粱饅頭、黃金糕的樣品制成不同濃度的樣品，按上述方法測定，結果：玉米饅頭、青團、高粱饅頭均未檢出檸檬黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍，黃金糕檢出檸檬黃，其余四種合成著色劑均未被檢出。3.討 論3.1 現在市面上的有色饅頭有三種，分別為顏色來自于食品本身的天然色素，來自于添加的色素，來自于食品本身的色素和人為添加的色素。第三種的樣品前處理最難，由于天