1、.：.；1 緒論 1.1 植物組織培育的普通概念 廣義的組織培育，不僅包括在無菌條件下利用人工培育基對植物組織的培育，而且包括對原生質體、懸浮細胞和植物器官的培育。Gamborg曾根據所培育的植物資料的不同，把組織培營養為5種類型，即愈傷組織培育，懸浮細胞培育、器官培育(胚、花藥、子房、根和莖的培育等)、莖尖分生組織培育和原生質體培育。其中愈傷組織培育是一種最常見的培育方式。 1.1 植物組織培育的普通概念所謂愈傷組織，原是指植物在受傷之后于傷口外表構成的一團薄壁細胞，在組織培育中，那么指在人工培育基上由外植體長出來的一團無序生長的薄壁細胞。愈傷組織培育所以是一種最常見的培育方式，是由于除莖尖

2、分生組織培育和一部分器官培育以外，其他幾種培育方式最終也都要閱歷愈傷組織才干產生再生植株，此外，愈傷組織還經常是懸浮培育的細胞和原生質體的來源在組織培育中，當我們把分化組織中的不分裂的靜止細胞，放在一種能促進細胞增殖的培育基上以后，細胞內就會發生某些變化，從而使細胞進入分裂形狀。一個成熟細胞轉變為分生形狀的過程叫做脫分化 。在組織培育中，我們把由活植物體上切取下來以進展培育的那部分組織或器官叫做外植體一個成熟的植物細胞閱歷了脫分化后之所以還能再分化而構成完好的植株，是由于這些細胞具有全能性。所謂全能性，就是說，任何具有完好的細胞核的植物細胞，都擁有構成一個完好植株所必需的全部遺傳信息。對已分化

3、的細胞的全能性的實驗研討闡明，至少在某些情況下，發育和分化過程并不導致細胞中遺傳信息的喪失或不可逆的鈍化，所涉及的只是這些遺傳信息表達調控機制的改動。 有關全能性的一定實驗證據是Steward等人(1958)在以胡蘿卜根組織為外植體的組織培育實驗中得到的。當他們把栽培胡蘿卜次生韌皮部薄片培育在一種含有椰子汁的固體培育基上時，產生了由簡單的薄壁細胞組成的愈傷組織。把這些愈傷組織轉入到成分一樣的液體培育基中并不斷振蕩，又產生了由單個細胞和小細胞團組成的懸浮液。全能性只是一種能夠性，由以上的引見我們可以看到，要把這種能夠性變為現實性必需滿足兩個條件：一是要把這些細胞從植物體其他部分的抑制性影響下解脫

4、出來，也就是說必需使這部分細胞處于離體的條件下，二是要給予它們適當的刺激，即給予它們一定的營養物質，并使它們遭到一定的激素的作用。 一個已分化的細胞要表現它的全能性，必需閱歷上面所說的兩個過程，即首先要閱歷脫分化過程，然后再閱歷再分化過程。 脫分化是指植物在組織培育時，在激素調理下由成熟組織的細胞如葉細胞轉變為分生形狀的過程。再分化是指在植物組織培育過程中，分生形狀的細胞在激素的作用下分化轉變為成熟組織或器官的過程。脫分化后的細胞進展再分化的過程有兩種不同的方式，一種是器官發生方式，其中莖芽和根是在愈傷組織的不同部位分別獨立構成的，構成的時間能夠也不一致，它們為單極性構造，里面各有維管束與愈傷

5、組織相連，但在不定芽和不定根之間并沒有共同的維管束把二者連在一同，另一種是胚胎發生方式，即在愈傷組織外表或內部構成很多胚狀體，或稱體細胞胚，它們閱歷的發育階段與合子胚類似，成熟胚狀體的構造也與合子胚一樣。胚狀體是雙極性的，有共同的維管束貫穿兩極，可脫離愈傷組織在無激素培育基上獨立萌生。 普通以為，愈傷組織中的不定芽來源于一個以上的細胞，而體細胞胚只來源于一個細胞，因此由體細胞胚長成的植株各部分的遺傳組成該當是一致的，不存在嵌合景象，不過也有些作者在這類再生植株中同樣發現了嵌合景象，因此以為體細胞胚也來源于一個以上的細胞。 胚狀體：在愈傷組織構成以后，培育的細胞團中開場構成構造緊實，解剖構造類似

6、于胚的單細胞來源的培育物。我們稱之為胚狀體。在很多植物中，胚狀體的構造都是相當典型的，但在有些植物如小麥中，幼齡胚狀體的盾片往往變大變綠，構成通常所描畫的“葉狀構造，并且經常出觀早熟萌生的景象。 胚狀體與不定芽的區別最根本的特征是具有兩極性，即在發育的早期階段，從其方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都為單向極性。胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖構造上的聯絡，而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯絡。胚狀體的維管組織的分布是獨立的“v字形，而不定芽的維管組織無此景象胚狀體與合子胚的比較合子胚胚狀體質量萌生率高，質量好萌生率低，質量差來源受精卵體細胞胚柄有，明顯即使

7、有也不明顯形狀固定，體積相對較小復雜，常有兩個以上的子葉體積相對較大變異率低高經過胚狀體途徑產生再生植株有3個顯著的優點，首先，在一個培育物上所能產生的胚狀體數目往往比不定芽的數目多(例如在一個離體培育的煙草花藥上可以產生200個以上的胚狀體);其次，胚狀體構成的速度快，第三，胚狀體構造完好，一旦構成，普通都可直接萌生構成小植株，因此成苗率較高。12 植物組織培育的開展簡史 雖然組織培育技術的蓬勃開展只是近五十年來的事，但它的整個歷史可以追溯到十九世紀末和二十世紀初。從那時起到如今，組織培育的開展過程大致可以分為三個階段： 本世紀初，在Schleiden和Schwann所開展起來的細胞學說的推

8、進下，德國植物生理學家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至分到單個細胞的觀念。 為了論證這一觀念，他在參與了蔗糖的Knop溶液中培育單個離體細胞，所選用的資料是小野芝麻和鳳眼蘭的柵欄組織和虎眼萬年青屬植物的表皮細胞等。遺憾的是，雖然在柵欄細胞中他明顯看到了細胞的生長、細胞壁的加厚和淀粉的構成等，但沒有一個細胞在培育中可以發生分裂。 Haberlandt實驗失敗的緣由，如今看來主要在于兩點：第一，他所選用的實驗資料都是曾經高度分化了的細胞，第二，所用的培育基過于簡單，特別是培育基中沒有包含誘導成熟細胞分裂所必需的生長激素，這是由于生長激素在當時還沒有發現。然而，做為植

9、物組織培育的先驅者，Haberlandt的奉獻不僅在于初次進展了離體細胞培育的實驗，而且在其1902年發表的“植物離體細胞培育實驗的報告中，還提出了胚囊液在組織培育中的作用和看護培育法等科學的預見。 自Haberlandt的實驗之后，直到1934年White培育番茄離體根尖的勝利，在其間的32年時間里，植物組織培育技術幾乎沒有什么進展，只是在以下兩個方面進展了一些初步的探求。 Laibach(1925，1929)把由亞麻種間雜交構成的不能成活的種子中的胚剖出，在人工培育基上培育至成熟，從而證明了胚培育在植物遠緣雜交中利用的能夠性； 到了30年代中期，植物組織培育領域里出現了兩個重要的發現，其一

10、是，認識了B族維生素對植物生長的重要意義，二是發現了生長素是一種天然的生長調理物質。 導致這兩個發現的主要是White和Gautheret的實驗。1934年，White由番茄根建立了第一個活潑生長的無性系，使根的離體培育實驗初次獲得了真正的勝利。起初，他在實驗中運用的培育基包含無機鹽、酵母浸出液和蔗糖。后來(1937)，他用3種B族維生素，即吡哆醇，硫胺素和煙酸，取代酵母浸出液獲得勝利。在這個以后被稱為White培育基的合成培育基上，他把某些于1934年建立起來的根培育物不斷保管到1968年他逝世前不久。與此同時，Gautheret(1934)在山毛柳和黑楊等構成層組織的培育中發現，雖然在含有

11、葡萄糖和鹽酸半胱氨酸的Knop溶液中，這些組織也可以不斷增殖幾個月，但只需在培育基中參與了B族維生素和IAA以后，山毛柳構成層組織的生長才干顯著添加.由于這些實驗提示了B族維生素和生長素的重要意義，又直接導致了1939年Gautheret延續培育胡蘿卜根構成層獲得初次勝利。同年，White由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜，也建立了類似的延續生長的組織培育物。因此，Gautheret， White和Nobecourt一同被譽為植物組織培育的奠基人。40年代和50年代初期，活潑在植物組織培育領域里的研討者以Skoog為代表，研討的主要內容是利用嘌呤類物質處置煙草髓愈傷組織以控制組

12、織的生長和芽的構成。 Skoog(1944)以及Skoog和崔澂等(1951)發現，腺嘌呤或腺苷不但可以促進愈傷組織的生長，而且還能解除培育基中生長素(IAA)對芽構成的抑制造用，誘導芽的構成，從而確定了腺嘌呤與生長素的比例是控制芽和根構成的主要條件之一。 這些實驗結果導致了激動素的發現和以后利用激動素和生長素在組織培育中控制器官分化任務的開展。在40年代，組織培育技術的另一項開展是Overbeek等(1941)初次把椰子汁做為補加物引入到培育基中，使曼陀羅的心形期幼胚可以離體培育至成熟。到50年代初，由于Steward等在胡蘿卜組織培育中也運用了這一物質，從而使椰子汁在組織培育的各個領域中都

13、得到了廣泛運用。 50年代開場以后，植物組織培育的研討日趨昌盛，10年當中引入注目的進展就有以下6項： 1952年，Morel和Martin初次證明，經過莖尖分生組織的離體培育，可以由已受病毒侵染的大麗花中獲得無毒植株19531954年，Muir進展單細胞培育獲得初步勝利。方法是把萬壽菊(Tagetes erecta)和煙草的愈傷組織轉移到液體培育基中，放在搖床上振蕩，使組織破碎，構成由單細胞和細胞聚集體組成的細胞懸浮液，然后經過繼代培育進展繁衍。Muir等還用機械方法由細胞懸浮液和容易散碎的愈傷組織中分別得到單細胞，把它們置于一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培育，使細胞發生了分裂。這種“看護培育

14、技術提示了實現Haberlandt培育單細胞這一想象的能夠性。1955年，Milier等由鯡魚精子DNA中分別出一種初次為人所知的細胞分裂素，并把它定名為激動素(kinetin)。如今，具有和激動素類似活性的合成的或天然的化合物已有多種，它們總稱為細胞分裂素(cytokinin)。運用這類物質，我們就有能夠誘導曾經成熟和高度分化的組織(如葉肉和干種子胚乳)的細胞進展分裂。1957年，Skoog和Miller提出了有關植物激素控制器官構成的概念，指出在煙草髓組織培育中，根和莖的分化是生長素對細胞分裂素比率的函數，經過改動培育基中這兩類生長調理物質的相對濃度可以控制器官的分化：這一比率高時促進生根

15、，低時促進莖芽的分化，二者濃度相等時，組織那么傾向于以一種無構造的方式生長1958年，Wickson和Thimann指出，運用外源細胞分裂素可促成在頂芽存在的。后來，Murashige開展了這一方法，制定了一系列規范程序，把這一方法廣泛用于由蕨類植物到花卉和果樹的快速繁衍上。19581959年，Reinert和Steward分別報道，在胡蘿卜愈傷組織培育中構成了體細胞胚。這是一種不同于經過芽和根的分化而構成植株的再生方式。如今知道有很多物種都能構成體細胞胚。在有些植物如胡蘿卜和毛茛中，現實上由植物體的任何部分都可以得到體細胞胚。 60年代以來組織培育技術所以得到了迅速開展，一方面是由于有了前6

16、0年建立的實際和技術根底，另一方面是由于這項技術開場走出了植物學家和植物生理學家的實驗室，經過與常規育種、良種繁育和遺傳工程技術相結合，在植物改良中發揚了重要的作用，并且在假設干方面曾經獲得了可觀的經濟效益。60年代以來組織培育技術的開展，概括起來可以分為三個方面：(1)原生質體培育獲得艱苦突破 1960年，Cocking等人用真菌纖維素酶分別植物原生質體獲得勝利，大大激發了人們對原生質體培育的熱情。 1971年，Takebe等在煙草上初次由原生質體獲得了再生植株，這不但在實際上證明了除體細胞和生殖細胞以外，無壁的原生質體同樣具有全能性，而且在實際上可以為外源基因的導入提供理想的受體材在198

17、5年以前，作為糧食和飼料主要來源的禾谷類植物的原生質體培育鮮有突破，只是最近幾年間，水稻、玉米、小麥、高梁、谷子和大麥等的原生質體培育才相繼告捷。在這方面，中國學者做出了重要奉獻。 原生質體培育的勝利，促進了體細胞交融技術的開展。 (2)花藥培育獲得顯著成果 1964年，Guha和Maheshwari報道，在南洋金花中經過離體花藥培育由小孢子直接發育成胚。 1967年，Bourgin和Nitsch經過花藥培育獲得了完好的煙草植株。由于單倍體在突變選擇和加速雜合體純合化過程中的重要作用，這一領域的研討在整個70年代得到了迅速開展，獲得勝利的物種數目添加到160余種，其中包括很多種重要的栽培植物。

18、煙草、水稻和小麥等的花培育種在中國獲得了引人注目的成就。 (3)微繁技術得到廣泛運用 1960年，Morel提出了一個離體無性繁衍蘭花的方法，繁衍系數極高。由于這一方法有宏大的適用價值，很快被蘭花消費者所采用，迅速建立起“蘭花工業，目前，用這種方法繁衍的蘭花至少已有35個屬150余種。 除蘭花外，在其他很多欣賞植物和經濟作物(如甘蔗和草莓等)中，微繁也已到達了工廠化的消費規模，在假設干作物中與經過莖尖培育進展脫毒相結合，產生了可觀的經濟效益。 13 組織培育與農業的關系組織培育一方面可為遺傳工程提供理想的受體資料，另一方面又可為常規的植物改良程序提供一種新的手段，從而使很多用傳統方法難以處理的

19、問題迎刃而解，更多更快更好地發明出各種農作物和園藝植物的新種類、新類型和新種質。 例如：在自花授扮作物雜交育種中，或在異花授粉作物自交系選育過程中，采用花藥培育技術不但可縮短雜合體純合化所需的時間，而且還可以節省土地面積，假定兩個雜交親本在n個獨立遺傳的位點上彼此不同，經過花藥培育，在實際上只需有2n個F1代花粉植株，就有能夠得到一個所需求的基因組合，而利用傳統育種方法，那么至少要有4n個F2植株才干得到這樣一個組合。 在遠緣雜交中，經過離體授粉或原生質體交融有能夠抑制受精前妨礙，經過幼齡合子胚培育可以抑制受精后妨礙，經過體細胞交融還有能夠制造出細胞質雜種。 對于無藥可治的病毒病，可經過莖尖培

20、育消除病毒，這對處理馬鈴薯種薯退化問題能發揚重要作用，在其它很多植物中也可用以建立無毒原種。 經過離體誘導不定芽或促進腋芽生枝，可對很多重要的園藝植物和名貴花卉、樹種進展快速繁衍。 運用在細胞程度上進展突變體選擇的技術，可以在一定程度上使高等植物的育種程序微生物化，從而大大提高選擇效率，節省時間和土地面積，并且不受季節的限制。體細胞無性系變異是除有性雜交和理化誘變之外的第三個變異來源，這種變異在育種中的利用價值曾經引起人們的廣泛留意。經過用人工種皮包被體細胞胚制造人工種子，為某些稀有和珍貴物種的繁衍提供了一種高效的手段。 利用藥用植物進展組織培育，消費有價值的次生代謝產物。如人參，三七中的藥用

21、成分皂苷可以大量消費。特別是在無性繁衍植物中，經過對莖尖分生組織等離體資料進展超低溫保管，不但可以大大節省空間，而且還不致遭到病蟲害的侵襲，并便于無毒種質的國際交換。 21 引言 一個組織培育實驗室的面積大小和配備程度取決于兩個要素：一是所要進展的實驗的性質，二是所能得到的經費的多少。 然而，一個規范的組織培育實驗室該當具備的設備：玻璃器皿、塑料器皿和其他實驗器皿的清洗和儲存；培育基的制備、滅菌和儲存；植物資料的無菌操作將培育物堅持在溫度、光照、能夠時還有濕度的可控條件下；培育物的察看。為此至少需求有兩個隔開的房間：一間用于玻璃器皿的清洗和儲存，以及培育基的制備(培育基室)，第二間用于放置培育

22、物(培育室)。培育室內應放一張桌子，上置雙筒解剖鏡和所需的光源，以便對培育物進展鏡檢。 221 培育基室 配制培育基所需的普通設備包括：任務臺其高度應適宜于站著任務，低溫冰箱用以儲存貯備液和椰子汁等，假設無低溫冰箱，在普通冰箱內也可短期儲存，普通冰箱用以儲存各種化學藥品、植物資料，和短期儲存貯備液等；大塑料瓶用以儲存蒸餾水；天平；電熱磁攪拌器用以溶解化學藥品酸度計吸氣機或真空泵用以輔助過濾滅菌；恒溫水浴鍋用以融化瓊脂，高壓滅菌鍋或家用壓力鍋 用以進展培育基滅菌222 培育容器 各種不同類型的容器都可用來培育植物資料。 玻璃試管 廣口玻璃瓶 牛奶瓶和罐頭瓶 塑料容器 耐高溫高壓的透明塑料封口 ，

23、橡皮圈箍扎 223 培 養 室 培育室的溫度該當是可控的，普通是用空調或熱風機使溫度堅持在252。 培育普通是在散射光下進展的，但有些情況下也需求較強的光照或完全黑暗，設備上對此該當有所預備。 當培育室的相對濕度降到50以下時，應采取措施添加濕度。普通應75%相對濕度。 進展懸浮培育，培育室內還應設有搖床 最好設置一臺備用發電機 在培育室內應設有假設干培育架以放置培育物 ，每層分別裝有日光燈管 ，小風扇。23 技 術 231 玻璃器皿和塑料器皿的清洗傳統方法是用洗液(重鉻酸鉀和濃硫酸混合液)浸泡約4h 如今都運用特制的洗滌劑 放入高壓鍋中滅菌 超聲波洗滌柜232 滅 菌培育基的污染有幾個能夠的

24、來源：1培育容器，2培育根本身，3外植體，4接種室的環境，5在接種和繼代時用以操作植物資料的器械，6培育室的環境。下面討論防止由這些來源呵斥污染的各種措施1培育基 置于高壓滅菌鍋中，由培育基到達要求溫度的時辰算起，在106kgcm2的壓力下(121)消毒1540min。滅菌作用取決于溫度，而不是直接取決于壓力。所需的時間隨著要進展消毒的液體的容積而變化 當冷卻被消毒的溶液時必需非常留意，假設壓力急速下降，超越了溫度下降的速率，就會使液體滾沸，從培育容器中溢出。只需當高壓滅菌鍋的壓力表指針回到零(溫度不高于50)時，才干翻開滅菌鍋。 某些生長調理物質(如GA，、玉米素，ABA)，尿素以及某些維生

25、素等，遇熱時容易分解，不能進展高壓滅菌。 熱分解化合物溶液的滅菌是經過濾膜過濾進展的，然后再將之參與高壓滅菌過的培育基中在進展溶液過濾消毒時，可運用孔徑為045微米或更小的細菌濾膜。 過濾器的滅菌溫度非常重要，不應超越121 過濾滅菌的操作：把一個裝有需求滅菌的溶液的帶刻度注射器(不用消毒)安到已滅過菌的過濾器組件的一端，緩慢地推進溶液使之穿越安在這個過濾器組件中間的細菌濾膜，過濾后的溶液由過濾器組件的另一端滴下來，直接參與培育基中2玻璃器皿、塑料器皿和器械 玻璃培育容器經常與培育基一同滅菌 對于無菌操作所用的各種器械，如鑷子、解剖刀、解剖針和 扁頭小鏟等，普通的消毒方法是把它們先在95酒精中

26、浸一下， 然后再置火陷上灼燒，待冷卻后運用。 3植物資料 有假設干種滅菌劑可用來進展植物組織消毒， 該當正確選擇消毒劑的濃度和處置時間，以盡量減少組織的死亡。普通來說，假設外植體較硬較大，容易操作，可直接用滅菌劑進展處置。 假設要培育柔嫩的莖尖或花粉粒，須分別把莖芽或花蕾進展外表消毒，然后在無菌條件下取出外植體。這類外植體普通都不帶污染微生物4接種區 最后必需特別強調的一點是，無論是接種還是繼代，當培育容器敞著口的時候，必需從各方面留意防止任何污染物進入容器，為此一切的操作都必需在嚴厲的無菌條件下進展。近年來多數實驗室都運用各種類型的超凈任務臺進展無菌操作。 超凈任務臺-內都裝有一個小電動機

27、,粗過濾器,細過濾器,空氣的速度大約是273mmin。植物組織無菌培育的普通步驟 置于一個有螺絲蓋的玻璃瓶中 濃度適當的消毒液 無菌蒸餾水34次 將資料取出，置于一個曾經滅過菌的培育皿中 對所要運用的器械進 行消毒 運用這些消過毒的器械 外植體接種到培育基上 瓶口置酒精燈火焰上烘烤 數秒鐘，然后迅速用瓶蓋或瓶塞封嚴 第三章 培育基1 培育基的種類及組成培育基：供植物離體培育用的基質，相當于人工配制的“土壤。由無機營養物、碳源、維生素、生長調理物質、有機附加物、水和介質等幾大類組成，為培育物提供營養、水分和固定場所。在植物生物技術的開展進程中，研討者們根據不同的研討目的和培育物對營養的需求，開發

28、出數十種組份各異的培育基配方見附錄I。對于培育基的命名，普通采用“發明人發表年份或“培育基代號發表年份表示，例如Murashige和Skoog1962也可表示為MS1962。培育基的類別，根據形狀不同可分為固體培育基和液體培育基，前者因加有固化劑如瓊脂或卡拉膠而呈固體形狀，后者不加固化劑，培育基為液體。兩類培育基的操作和運用目的差別較大根據培育基中能否加有生長調理物質和附加物質，那么可將培育基分為根本培育基和完全培育基，前者只含有無機營養物包括大量元素和微量元素、維生素、氨基酸、碳水化合物和水。后者在前者，即根本培育基的根底上，根據各種不同實驗要求，附加一些物質，如各種植物生長調理劑：BA、Z

29、T、KT、2-iP、2,4-D、NAA、IAA、IBA、GA等，以及其他的復雜有機附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麥芽膏等。由于離體的培育資料不象完好植物體那樣具有自我平衡的才干，所以在配制培育基時，還應思索離子平衡和物質平衡問題，離子失衡或某種物質過量都能夠導致培育物死亡。目前，無論液體培育還是固體培育，大多數植物離體培育中所用的培育基都是由無機營養物、碳源、維生素、生長調理物質和有機附加物等幾大類組成.1.1 無機營養物無機鹽類無機營養物主要包括大量元素和微量元素，有時也包括少許有益元素。大量元素包括N、P、K、Ca、Mg、S，它們是植物細

30、胞中構成核酸、蛋白質、酶系統、葉綠體以及生物膜所必不可少的元素。1.1 無機營養物無機鹽類-NN通常為硝態氮或銨態氮，在培育基中多以KNO3或NH4NO3的方式提供，或將硝態氮與銨態氮配合運用，培育基中一定濃度的氮素不僅為培育物的生長提供營養，而且是胚胎發生的必需條件之一。普通而言，培育基中至少需求含有各為25mmol.L-1的硝酸鹽和鉀鹽。銨的含量超越8mmol.L-1時對培育物有毒害作用，但對常規的愈傷組織培育和細胞懸浮培育來說，假設硝態氮和銨態氮同時存在，那么培育基中的總N量可提高到60mmol.L-1。1.1 無機營養物無機鹽類-P.KP是植物的必需元素之一，參與生命活動中核酸及蛋白質

31、合成、光協作用、呼吸作用以及能量的儲存、轉化與釋放等重要的生理生化過程，在離體培育中需求大量的P；K是主要的陽離子，近年來在培育基中的用量呈逐漸提高的趨勢；Ca、Mg、S的用量相對少一些，濃度在13mmol.L-1范圍內較適宜。1.1 無機營養物無機鹽類微量元素是指Fe、Cu、Mn、B、Zn、Mo和Cl等，其需求量很少，普通用10-510-7mol.L-1,過多那么產生毒害。另外，Cl在自然界廣泛存在，普通無須另行添加。有益元素是指非必需的、但對培育物的生長發育有益的一些元素，如硅Si、碘I、硒Se、鈷Co和鈉Na等，在某些植物如水稻、鹽生植物、C4植物和景天酸代謝植物的離體培育中常有運用，另

32、外，幾乎一切的培育基配方中都含有碘元素。各種元素中，除Fe以螯合方式(如Fe-EDTA)供應、少部分的氮素由有機氮供應外，其它的元素普通以離子態提供。1.2 碳源carbon sources和能源離體培育中的外植體資料，由于其光協作用才干較低，需求在培育基中添加一些碳水化合物作為生長發育的能源，這些碳源物質包括糖類物質、醇類物質和有機酸，以糖類物質最為重要。它們的作用除了提供培育物所需的碳骨架外，還提供能源，并可調理浸透壓普通地說，蔗糖是最好的糖源。它具有熱易變(heat-liable)的性質，經高壓消毒后，大部分分解為D-葡萄糖、D-果糖，有利于培育物吸收。其次，是葡萄糖和果糖。棉子糖在胡蘿

33、卜離體培育中的作用，僅次于蔗糖和葡萄糖，但比果糖效果好。山梨糖醇那么是薔薇科植物培育物的最好或較好的糖源，這能夠與它在薔薇科植物活體中也是最占優勢的糖類物質有關。淀粉作為碳源對含糖量較高的植物組織來源，有較好的效果。大多數植物細胞對蔗糖的需求范圍是15%可維持的浸透壓范圍在-152-145 kPa，過低的糖濃度不能滿足細胞營養、代謝和生長的需求，但過高的糖也是不利的，能夠會干擾正常糖類物質的代謝，或導致培育系統的浸透壓添加，從而妨礙了細胞對水分的吸收。在幼胚培育、花藥培育和原生質體培育時，需求較高濃度的糖類物質，普通為10%左右或更高。原生質體培育時，假設糖類(以及醇類)的濃度不夠高，原生質膜

34、外的浸透壓比膜內的低得多，原生質體就會破裂除單糖外，其他糖普通須在細胞體外分解后而被吸收。植物細胞壁中存在著各種水解酶。胡蘿卜的轉化酶比較弱地結合在細胞壁中，假設用酶法制取原生質體，有5060%的酶稀釋于培育基中。假設以蔗糖為糖源對這種細胞進展液體培育，那么大約經12小時后，絕大部分解為葡萄糖和果糖。維生素類維生素類的種類很多，與植物體內各種酶的構成有關。由于離體培育中外植體合成維生素的才干較弱，需加部分的外源維生素才干利于發育。在離體培育中通常以B族維生素為主，運用濃度普通為0.110mg.L-1。其中，鹽酸硫胺素VB1是幾乎一切的培育物所必不可少的，而煙酸、鹽酸吡哆素(VB6)、生物素及維

35、生素C和B12也比較常用。VB1用量在0.10.3mg.L-1之間，特別是在低程度細胞分裂素的培育基中，更是不可少肌醇環己六醇是一種特殊的物質，其本身不促進外植體的生長，但能夠有助于化學物質發揚作用，特別是能提高VB1的效果，從而促進外植體生長、胚狀體發育和芽的分化，肌醇的用量為50100mg.L-1。維生素類普通易溶于水，但耐熱性差，高溫下易降解。1.4 氨基酸、酰胺類及有機附加物在一些培育基中參與一些氨基酸，如甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等，除提高營養外，可起到緩沖和調理培育物的體內營養平衡的作用，可以促進離體根的生長，促進培育物的生長發育。例如絲氨酸和谷氨酰胺有利于花藥胚狀

36、體和不定芽的分化，水解酪蛋白CH和水解乳蛋白LH含有多種氨基酸，對胚狀體或不定芽的分化也有良好的促進作用氨基酸的通常用量為23mg.L-1，水解酪蛋白和水解乳蛋白的用量普通為0.050.1%。此外，有些情況下還可參與成份更復雜的天然復合物質，包括天然營養物、中草藥甚至保健品等，常用的為椰乳、酵母提取液、番茄汁和香蕉泥等，運用濃度分別為1020%、0.5%、510%和100200g.L-1，這些物質中含有天然激素等多種活性物質，香蕉泥還具有較好的pH緩沖作用，在蘭花離體培育中運用較多。椰乳CM，CW的活性成分是耐熱的，其制備方法為，將新穎椰子汁煮沸后用數層紗布過濾，去除蛋白質后冰凍保管備用。1.

37、5 植物生長調理劑生長調理物質是培育基中不可短少的關鍵物質，其用量雖然極少，但對外植體愈傷組織的誘導和分化起著重要和明顯的調理作用，其中最常用的是生長素類和細胞分裂素類。生長素類生長素類是一類刺激細胞伸長的化合物，能引起細胞性質或次級代謝機能變化。生長素的主要作用是促進細胞伸長和細胞分裂，誘導受傷組織外表的一至數層細胞恢復分裂才干，構成愈傷組織、促進胚狀體的分化和試管苗的生根，另外，當生長素與一定比例的細胞分裂素配合運用時，還能誘導腋芽及不定芽的產生。常用的生長素有2,4-D2，4-二氯苯氧乙酸、NAA萘乙酸、IBA吲哚丁酸和IAA吲哚乙酸等，它們的活性強弱順序為2,4-DNAAIBAIAA。

38、IAA的運用濃度普通為10-510-10mol.L-1，常用110mg.L-1，2,4-D為10-510-7mol.L-1，NAA的濃度范圍那么比前兩者都大IAA是生物合成的激素，見光或在酶促氧化作用下容易降解失活。另外，因培育物細胞內含有IAA氧化酶，會破壞外源IAA的活性，故IAA的運用濃度普通較高130mg.L-1，NAA和2,4-D是人工合成的生長調理劑，性質穩定，不會被酶氧化和降解，運用濃度以普通以0.12mg.L-1為宜。細胞分裂素類現已發現天然的細胞分裂素物質約十多種，同時也有一些人工合成的物質具有細胞分裂素活性，這些物質統稱為細胞分裂素。常用的細胞分裂素有激動素KT、6-卞基腺

39、嘌呤6-BA、玉米素ZT、2-異戊烯腺嘌呤2-iP、腺嘌呤AD、二苯脲、吡效隆4PU，CPPU和噻重氮苯基脲TDZ，又名苯基噻二唑基脲等.它們的主要作用是： 促進細胞分裂與擴展； 誘導芽的分化，促進側芽的萌生與生長； 加強蛋白質的合成，抑制衰老； 可以改動其它激素的作用。其活性的強弱順序為TDZ，4PUZT2-iP6-BAKTAD。最常用的分裂素是性質穩定、價錢適中的6-BA和KT，運用濃度為10-610-7mol.L-1。赤霉素類赤霉素GA，市售的GA是赤霉菌發酵液的粗提物，含有多至15種的赤霉素，離體培育中運用的赤霉素普通是赤霉酸GA3，也是一種天然產物，溶于甲醇、乙醇或碳酸氫鈉溶液，在水

40、中會迅速分解，故需用乙醇溶解并保管。赤霉素的主要作用是，誘導莖的細胞伸長，對根的細胞那么無效；對構成層的細胞分化有影響，往往同生長素有協同作用，即IAA/GA比值高有利于木質部分化，比值低那么利于韌皮部分化；可以替代低溫暖長日照，使一些兩年生植物在當年就開花，加快發育進程，具有突破休眠、促進休眠種子和器官萌生的作用；此外，赤霉素還對生長素和細胞分裂素的活性有增效作用。零落酸ABA除特殊的研討外，植物離體培育中普通不運用零落酸，但了解零落酸的知識是很有必要的，它可以協助 我們思索和分析問題，如激素間的相互作用、采樣時期、環境條件、培育基及培育條件的情況對培育資料的影響等。普通地，零落酸具有抑制蛋

41、白質合成、抵消或抑制生長素、細胞分裂素和赤霉素發揚作用的效果，并可以誘導休眠、促進衰老和零落的發生。但是，也有報道以為ABA對培育物的形狀發生有促進作用，例如甘薯塊根和柳杉下胚軸切段培育物產生芽，荔枝幼胚培育產生胚狀體等。近期植物生理學的研討進展闡明，零落酸是一類生理作用相當復雜的激素，它在離體培育中的作用需求進一步的研討。乙烯及其它生長抑制劑幾乎一切的植物組織都能產生乙烯。乙烯的生理作用有，促進果實成熟、促進脫葉和衰老；促進次生物質的排泌；促進菠蘿開花、添加黃瓜等的雌花數量等在離體培育中，生長素用量過高會誘發產生乙烯；當培育物生長得太密集擁堵、長期不予繼代轉接時，乙烯含量會增高，從而加速培育

42、物衰老或脫葉，較高的乙烯還引起植物在形狀上的一些改動，如使豌豆的上胚軸加粗、失去負向地性等。除此之外，離體培育中有時還會用到多效唑、烯效唑、三碘苯甲酸TIBA、矮壯素、比久B9、根皮苷、間苯三酚根皮酚等生長抑制劑，用以抑制徒長或細胞的旺盛分裂，提高試管苗的質量。有研討證明根皮苷可提高蓮葉秋海棠、雪松、月季的芽苗分化，根皮苷分解后產生的根皮酚也有類似的效果，三碘苯甲酸那么可以促進秋海棠的離體培育葉片構成芽。根皮苷的用量普通為17mg.L-1。1.6 瓊脂或卡拉膠瓊脂是從紅藻等海藻中提取的一種高分子碳水化合物，其主要作用是使培育基在常溫下凝固，它不參與代謝、不提供營養但不純的瓊脂中常會有一些微量元

43、素，在植物離體培育中不斷被作為首選的固化劑。瓊脂的用量普通在410g.L-1之間。近年來一些廠家消費的“卡拉膠為粉狀的瓊脂，其用量應小于條狀瓊脂假設是研討植物組織或細胞的營養問題，那么應防止運用瓊脂，由于市售的瓊脂幾乎都含有一些雜質，特別是鈣、鎂和一些微量元素。瓊脂純化：為了得到更純真的瓊脂，可將干瓊脂450g放在8L大瓶中，加蒸餾水5L和吡啶0.5L，20小時后濾去液體，用蒸餾水沖洗3次，再用95酒精浸泡12小時，取出并晾干。瓊脂的凝固才干除與原料、廠家和加工方式有關外，還與高壓滅菌的溫度、時間、pH值等要素有關，長時間的高溫會使凝固才干下降，過酸及高溫會使瓊脂發生水解，失去凝固才干。存放時

44、間過久，也會逐漸失去凝固力，在運用中應留意1.7 活性炭活性炭的作用,利用其吸附才干降低分泌物的毒害作用; 可使培育基變黑，有利于大多數植物的離體生根；對形狀發生和器官構成有良好的效應.例如，活性炭可以促進花藥培育時的雄核發育，有利于構成單倍體植株；懸浮培育的胡蘿卜細胞失去胚狀體發生才干后，經過添加14%的活性炭可恢復其胚胎發生才干。普通以為，活性炭具有強大的吸附才干，可以吸附非極性物質和色素等大分子，但其吸附的選擇性很差，既吸附有害物質，也吸附有利物質如激素和維生素類等，故運用的濃度不宜過高，普通在0.10.5%。活性炭的吸附才干還與溫度有關，低溫下吸附才干強，高溫下吸附才干減弱，甚至解吸附

45、。另外，大量的活性炭會減弱瓊脂的凝固才干，此時需提高瓊脂的用量，很細的活性炭粉末容易沉淀，應在培育基凝固之前搖擺混勻1.8 硝酸銀AgNO3中的Ag+經過競爭性地結合于細胞膜上的乙烯受體蛋白，能起到抑制乙烯活性的作用。因此，在培育基中參與適量的AgNO3，有促進愈傷組織分化器官或胚狀體的作用，能使某些原來再生困難的物種再生植株，并對抑制試管苗玻璃化、早衰及落葉等有明顯效果。1.9 染色劑的利用在進展離體培育研討時通常需配制不同的培育基，或參與不同的植物激素，以察看培育物的變化，確定最適宜的配方。除了用鉛筆或油筆標志外，一個可行的方法，是在培育基中滴加13滴1的活體染色劑，如亞甲蘭、中性紅、甲基

46、紫等，將培育基染成不同的淡顏色，由于染色劑用量極微，不會對培育物產生影響，利用此法可以節約大量的時間。另外，甲基紫除供染色之外，還具有較強的殺菌作用，0.001即可有效地抑制細菌和部分真菌的生長1.10 抗生素的利用對于內生菌的情況，可運用抗生素類物質進展抑菌，經實驗，甲基托布津、多菌靈、百菌清都有較好的效果，另據報道，鏈霉素、青霉素、地霉素、新霉素、夾竹桃霉素、抗菌肽等物質都具有降低內生菌污染的效果，可酌情試用。2 幾類常用培育基的特性自1937年White建立第一個植物組織培育的公用培育基以來，許多研討者報道了相當多的培育基配方，這些配方因其成分主要是無機鹽程度的不同，可以大體劃分成幾類，

47、并各具特點而適用于不同的培育目的。 根據無機鹽用量，培育基類型可以分為高鹽型培育基，高KNO3型培育基，中鹽型培育基， 低鹽型培育基。2.1 高鹽型培育基MS是運用最廣泛的培育基。其特點是無機鹽濃度高，營養齊全，銨態氮和硝態氮含量高，比例也比較適宜，不需求添加更多的有機附加物，離子平衡情況較好，運用的誤差較小。利于愈傷組織的誘導和增殖，能滿足植物組織對礦質營養的要求，適用于高需肥量植物種類或生長迅速的培育資料。MS根本培育基的全部組份見243頁附錄4。與MS培育基較為接近的配方，還有LS1965和RM1964，它們的根本成分均同于MS，但前者去掉了甘氨酸、煙酸和鹽酸吡多醇，后者那么把硝酸銨從1

48、650mg.L-1升至4950mg.L-1，磷酸二氫鉀從170mg.L-1升至510mg.L-1，成為一個極高鹽的配方。可歸入此類的配方還有BL，BM，ER和MT等2.2 高KNO3型培育基 對于喜鉀、喜硝或忌銨的外植體資料而言，選用此類培育基是比較適宜的，此類配方有B51968和N61974，前者的特點是銨鹽較低，鹽酸硫胺素較高，對枇杷胚狀體的誘導效果較佳。后者由我國的朱至清等發明，高硝酸銨，不含鉬，特別適用于禾谷類作物的花藥培育，曾獲國家發明二等獎，在國內外都有廣泛的運用。2.3 中鹽型培育基 中鹽型培育基包括H1967，Nitsch1969和Miller1963等，在離體培育中也有廣泛的

49、運用。2.4 低鹽型培育基 低鹽型培育基的特點是無機鹽濃度低，適用于生根培育、成熟胚胎培育或種質資料的保管，包括White1943，改良White1963，HB1963，WS1966和Knop1965等，其中Knop1965僅包括4種成分，可用作水培的培育液，改良White1963那么比較多用于木本植物。3 培育基的配制用于配制培育基的水最好是蒸餾水或雙蒸水，所用的各種化學藥品應盡能夠采用分析純或化學純級別的試劑，以免雜質對培育物呵斥不利影響。 藥品的稱量及定容都要準確，不同的化學藥品需運用不同的藥匙，防止藥品的交叉污染與混雜。稱量時應特別仔細，每稱取一種藥品都應隨時記錄稱量情況(包括品名、分

50、量等)，以免反復或弄錯，又便于實驗后分析。國內化學試劑的分級與縮寫分級英文縮寫標簽顏色優級純試劑Guaranteed reagentGR綠分析純試劑Analytial reagentAR紅化學純試劑Chemical pureCP藍實驗試劑Laboratory reagentLR中黃3.1 母液配制及保管培育基的配制應遵照一定的方法程序。培育基母液：又叫貯備液，是在配制培育基時事先配好的濃縮液。培育基母液類型包括無機鹽、維生素以及在水溶液中穩定的生長調理物質等一個常規的方法是預先配制好不同組分的培育基母液，配成培育基配方運用濃度的10倍或100倍，甚至1000倍。平常儲存在24冰箱內，待配制培育

51、基時取出，按比例稀釋配用。這樣每種藥品稱量一次，可以運用多次，并可減少多次稱量所帶來的誤差。母液的配制有兩種方法：一種是配制成單一化合物母液，一種是配成幾種不同化合物的混合母液。前一種方法適宜配制多種培育基都需求的同一種母液，后一種方法在大量配制同種培育基時省時省力。配好的母液應保管在棕色瓶中儲存以MS為例引見培育基的制造方法該配方中除蔗糖和瓊脂外，還包括有19種成分，1.核實試劑，計算。2.配制母液。為減少配制母液的任務量，可把幾種藥品如培育基中的大量元素或微量元素配在同一母液中，但應留意各種化合物的組合以及參與的先后順序，以免發生沉淀。通常把每種試劑單獨溶解后再與別的也已完全溶解的藥品混合

52、，或者待前一種化合物完全溶解后再參與后一種化合物。混合已溶解的各種無機鹽時還應留意先后順序，必需把CaCl2與SO42-和PO43-錯開，以免構成硫酸鈣或磷酸鈣的不溶物，另外，Fe2+容易與某些陰離子如OH-結合構成沉淀而失效，故鐵元素需單獨配制成螯合鐵母液。對于植物生長調理物質，配制成母液時，普通宜配制成0.5或1.0mg.mL-1的母液，這樣的濃度既便于計算也可防止冷藏時構成結晶。由于多數生長調理物質難溶于水，因此配法各不一樣。大體上，酸類物質如生長素類和零落酸和苯基脲類物質可用少量的1mol.L-1 NaOH溶解，蒸餾水定容，堿類物質如腺嘌呤的衍生物可用數滴1mol.L-1的HCl溶解，

53、蒸餾水定容，GA3用95酒精溶解及定容，玉米素可先溶于少量95酒精中再加水定容。另外，IAA，IBA、NAA和2,4-D也可用95酒精溶解，蒸餾水定容。一切的生長調理劑母液應貯于試劑瓶中，存放在冰箱內避光保管。植物生長調理物質濃度的表示有兩種單位：以前常用ppm(或每升毫克數)，現狀更提倡用mol.L-1，它們之間的換算方法見有關資料。3.貼標簽。配制好的各種母液應分別貼上標簽，寫明母液稱號、配制倍數、日期及配1L培育基時應汲取的量。母液最好在24的冰箱中保管。尤其對生長調理物質與有機類物質要求較嚴。儲存時間不宜過長，如發現有霉菌和沉淀結晶產生，就不能再運用。3.2 培育基的煮制 配制培育基時

54、先將儲存母液按順序放好，將干凈的各種玻璃器皿、量筒、燒杯、移液管、玻璃棒、漏斗等放在指定的位置。稱量好所需的瓊脂、蔗糖、蒸餾水，配好所需用的生長調理物質，預備好分裝容器。先在燒杯或鍋內放一定量的蒸餾水，參與瓊脂和蔗糖并加熱溶解，然后按母液順序，根據不同母液的不同倍數汲取規定的量。加完一切的培育基組份包括所需的生長調理物質后，繼續加溫并不斷攪拌，待瓊脂完全溶化后定容3.3 pH值的調整 由于培育基的pH值直接影響到培育物對離子的吸收，因此過酸或過堿都對植物資料的生長有很大影響；另外，培育基的pH值還影響瓊脂的凝固。所以，當培育基配制好后應立刻進展pH值的調整。最好用酸度計測試，既快又準，如無條件

55、也可用精細pH試紙，但最好多用一兩種試紙同時測定，免得一種pH試紙偏向太大而明顯影響外植體的生長。 培育基假設偏酸時用l mol.L-1的NaOH來調理，偏堿那么用1 mol.L-1的HCl調理。普通將培育基的pH值調理到5.46.0。假設pH值高于6.0，培育基會變硬，pH值低于5.0，那么不能很好地凝固。pH計/酸度計 PH試紙3.4 培育基的分裝與滅菌配制好的培育基要趁熱分裝。普通以占試管、三角瓶等培育容器的1/51/4為宜。太多會浪費培育基，而且減少培育資料的生長空間；太少那么會因營養不夠而限制生長。當用試控制備瓊脂固化培育基時，假設是用于初代培育，最好把試管斜置，將培育基制成斜面，為

56、外植體的接種提供一個較大的面積，便于察看生長效果。培育基分裝后應立刻進展熱壓滅菌處置。假設不能及時滅菌，那么應放入冰箱或冰柜中，在24h內完成滅菌任務高壓滅菌鍋的運用本卷須知：1.消毒滅菌時，在壓力表讀數為1.1 kg/cm-2或0.1Mpa，121下堅持1520min.2.在蒸汽滅菌鍋增壓前應先將滅菌鍋內的冷空氣放盡。排冷空氣可用以下方法：事前翻開滅菌鍋放氣閥，煮沸15min后再封鎖或等大量熱蒸氣排出后再封鎖；3.培育基消毒滅菌時間不宜過長，也不可超越滅菌鍋規定的壓力范圍，否那么培育基中的蔗糖、有機物質，特別是維生素類物質就會分解，導致培育基蛻變、變色，甚至難以凝固。4.當滅菌完成后，應切斷

57、電源或熱源，待滅菌鍋內氣壓接近“0時，方可翻開放氣閥，擰開滅菌鍋蓋取出培育基。切勿為急于取出培育基而翻開放氣閥放氣，由于鍋內氣壓下降太快會引起減壓沸騰，導致滅菌鍋內各容器中的培育基溢出，呵斥浪費或污染，甚至燙傷任務人員。對于吲哚乙酸、玉米素及某些維生素等遇熱不穩定的生物活性物質，不能進展高壓蒸氣滅菌，應改用過濾方法滅菌。通常采用減壓過濾安裝和過濾滅菌器，前者主要由過濾器和抽氣系統兩部分構成。但一切器皿事先均應高溫蒸氣滅菌3.5 培育基的保管與運用 培育基凝固后，將其放到培育室中23d，假設沒有雜菌污染即可放心運用。暫時不用的培育基應放置于10下保管，而含有生長調理物質的培育基在45低溫下保管更

58、佳。含吲哚乙酸或赤霉素的培育基應在配制滅菌后1周內用完，其它培育基應在消毒后2周內用完，至多不超越1個月，以免枯燥蛻變生長調理劑配制過程先用有機溶劑或堿溶解, 溶解后將生長調理劑溶液倒入水中, 那么不是反過來。例子：高濃度的NAA配制時，假設是將水倒入已溶解的NAA溶液中，容易導致已溶解的NAA沉淀含生長調理劑的培育基滅菌方法通常參與到培育基中再高溫滅菌而活性不會明顯喪失的有: 2,4-D, NAA通常參與到培育基中再滅菌, 但活性會部分喪失的有: ABA, BA, GA3, IAA, IBA, KT, TDZ, ZT通常只采用過濾除菌的有: CPPU脲類細胞分裂素 , GA4, GA7, J

59、A茉莉酸甲酯 培育基母液的配制大量元素10倍母液：含NH4NO3, KNO3, MgSO4, KH2PO4, 宜4C冰箱內貯藏，也可滅菌后室溫貯藏微量元素1000倍母液, 含H3BO3, ZnSO4, MnSO4, Na2MoO4, CuSO4, CoCl2。后3者取用量很少, 稱量困難, 可以先配成10mg/ml的溶液, 然后汲取所需量。該母液宜分裝成1ml每管, 貯于-20C, 每次取1管配成1L培育基 抗生素的配制不同抗生素用不同溶劑溶解，如用水溶解的有：Amp，Carb，Kan，Cef；用甲醇或乙醇溶解的有：Cm，Rif，Tet。抗生素普通配制成100010000倍母液，總濃度普通在1

60、00mg/ml以內，頭孢霉素可達250mg/ml。抗生素用無菌水或有機溶劑配制后分裝冰凍保管，不用滅菌 。液體和固體培育基的配制液體培育基：先取適量水, 再加各種母液(抗生素和某些植物激素在滅菌冷卻后再加), 每加一種后攪拌均勻, 再稱取適量蔗糖和少數其它試劑, 溶解后調理pH, 定容。固體培育基：在液體培育基調理pH值前參與瓊脂或瓊脂粉，加熱溶解后調理pH值和定容。第四章離體培育根本技術-外植體第一節 外植體的類型及其選擇與處置外植體是指用于接種培育的各種離體的植物資料，包括胚胎資料、各種器官、組織、細胞甚至原生質體等。也就是說，外植體是從植物體上取下的用于離體培育的資料，而不論該資料是植物