1、微生物限度檢測方法學驗證方案文件編號：P-批準簽字頁方案起草崗位/職位姓名簽字日期微生物崗/QC人員方案審核崗位/職位姓名簽字日期微生物崗/組長生產部/部長質量部/QA監督員方案批準崗位/職位姓名簽字日期總工質量受權人目錄 TOC o 1-1 h z u HYPERLINK l _Toc260921720 1.目的 PAGEREF _Toc260921720 h 4 HYPERLINK l _Toc260921721 2.范圍 PAGEREF _Toc260921721 h 4 HYPERLINK l _Toc260921722 3.責任者及職責 PAGEREF _Toc260921722 h

2、 4 HYPERLINK l _Toc260921723 4.驗證簡介 PAGEREF _Toc260921723 h 4 HYPERLINK l _Toc260921724 5 驗證過程 PAGEREF _Toc260921724 h 7 HYPERLINK l _Toc260921725 6 結果判斷 PAGEREF _Toc260921725 h 8 HYPERLINK l _Toc260921726 7 結論和建議 PAGEREF _Toc260921726 h 8 HYPERLINK l _Toc260921727 8 異常情況報告 PAGEREF _Toc260921727 h 8

3、 HYPERLINK l _Toc260921728 9 再驗證 PAGEREF _Toc260921728 h 8 HYPERLINK l _Toc260921729 10附件 PAGEREF _Toc260921729 h 8 HYPERLINK l _Toc260921730 附件1：培養基的靈敏度復核 PAGEREF _Toc260921730 h 9 HYPERLINK l _Toc260921731 附件2：稀釋液的無菌性檢查 PAGEREF _Toc260921731 h 10 HYPERLINK l _Toc260921732 附件3：方法驗證 PAGEREF _Toc2609

4、21732 h 11目的按照中國藥典2010版（第三部），采用薄膜過濾法進行微生物限度檢查，本方案對新修訂的方法進行驗證。范圍本公司要求進行微生物限度檢查的原輔料和制劑，中間制品以及消毒劑。責任者及職責部門職責質量部QC起草并審核驗證方案進行驗證試驗的具體操作完成驗證記錄中相關操作記錄的填寫根據驗證結果起草和審核驗證報告總工負責審核并批準驗證方案和驗證報告質量部QA審核并批準驗證方案和驗證報告監督驗證方案的實施驗證簡介定義CFU：菌落數供試品對照組取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。試驗組當采取薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌加在最后一次沖洗液中，過濾后，取出濾膜

5、接入對應培養基中。菌液組測定所加的試驗菌數。稀釋劑對照組用相應的稀釋液替代供試品，按試驗組規定的方法進行菌落計數。樣品組樣品溶液菌懸液（50-100CFU）稀釋液平均菌落數(CFU/皿)供試液對照組+-+C供試液對照組試驗組+C試驗組菌液組-+-C菌液組稀釋劑對照組-+C稀釋劑對照組菌懸液菌種及來源培養基名稱名稱及代號編號批號有效期至來源營養瓊脂培養基金黃色葡萄球菌Staphlococcus aureusATCC6538ATCC大腸埃希氏桿菌Escherichia coliATCC8739枯草芽胞桿菌Bacillus subtilisATCC6633玫瑰紅鈉瓊脂培養基白色念珠菌Candida

6、albicansATCC10231黑曲霉Aspergillus nigerATCC16404備注檢查人： 復核人： 檢查日期： 菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，3035培養1824h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，2025培養2448h。上述培養物用無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數50100CFU的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，2328培養57天，加入35ml含（ml/ml）聚山梨酯80的無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內

7、，用含（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數50100CFU的孢子溶液。培養基及稀釋液培養基和稀釋液的名稱培養基：營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基稀釋液：的氯化鈉蛋白胨緩沖溶液、滅菌純化水培養基靈敏度復核 培養基靈敏度復核，參見培養基的靈敏度檢查操作規程QC252稀釋液的無菌性檢查對稀釋液進行無菌檢查，14天規定溫度培養后應無菌。此操作可與其它試驗同時進行。供試液的預處理樣品名稱及數量樣品編號樣品名稱取樣量/批批號 Sn-ASn-BSn-CS01*中間制品1000MLS02*成品200gS03原輔料1200gS04原輔料2200gS05原輔料.200gS06消

8、毒劑20mlS07飲用水100mlS08純水制備過程水100mlS09.備注檢查人： 復核人： 檢查日期： 樣品預處理方法*中間制品無需處理，取原樣品50ml作為供試液。*成品無需處理，取原樣品50ml作為供試液。原輔料1 取10g樣品，加入滅菌后的氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml,混勻待用；原輔料2取10g樣品，加入滅菌后的氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml,混勻待用；原輔料.取10g樣品，加入滅菌后的氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml,混勻待用；消毒劑（*）按照比例進行配制。取1ml樣品，加入滅菌后的氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml,混勻待用。飲用水取1ml樣品，加入滅菌后的純化水至100ml,混勻待

9、用。純水制備過程水取1ml樣品，加入滅菌后的純化水至100ml,混勻待用。實驗用品名 稱型 號設備編號廠 家半封閉薄膜過濾器millipore plusmillipore生化培養箱SHP-250上海試驗儀器廠 生化培養箱SPX-250B-Z上海博迅實業 醫療設備廠潔凈工作臺SW-20-2FD雷柏特生物安全柜NU-440-400E美國NUAIRE公司濾膜*mmillipore*濾膜材質為混合纖維素酯。參考文件 中國藥典2010版第三部附錄XIIG- 微生物限度檢查法驗證管理規程超標數據調查及處理管理規程異常情況管理規程培養基管理規程薄膜過濾法無菌檢查操作規程培養基的靈敏度檢查操作規程菌種復蘇、傳

10、代及菌懸液制備操作規程微生物限度檢查操作規程消毒劑微生物污染水平檢測操作規程5 驗證過程試驗次數：驗證試驗應進行3次獨立平行實驗試驗器具準備試驗前，將先前已準備的適量稀釋液和培養基靈敏度復核檢查合格的培養基、檢品、無菌濾膜和無菌濾杯一同放入無菌室的傳遞廚內。用消毒劑對無菌室進行消毒，并擦拭超凈臺，打開超凈工作臺風機及紫外燈滅菌1小時以上。 測定.1 按照無菌室更衣程序更衣，進入無菌室。.2 用70%酒精棉球擦拭工作臺面與待測品表面。.3 在無菌環境下，取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50100CFU，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固

11、，置30-35培養2天，計數；取4.2.2項下配制的白色念珠菌、黑曲霉各50100CFU，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23-28培養3天，計數；以上作為菌液組。 在無菌環境下，將過濾設備安裝完畢。.5 取適量稀釋液倒入濾杯中，待濾膜潤濕后進行以下操作。.6 將規定量的樣品加入過濾器內（濾膜d47mm；），減壓過濾。濾后，加10氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，重復n次（初步設定為3次，如需增加沖洗量可以適當增加沖洗次數，每次100ml，但總沖洗量不得超過1000ml），在最后一次的稀釋液當中加入.2項下配制的菌液，作為試驗組，平行操作一次

12、。.7 不加入菌液重復5.3.4-5.3.6，作為供試品對照組。.8 只加入稀釋液和.2項下配制的菌液作為稀釋劑對照組。.9 無菌操作取出濾膜，按下表加入對應培養基上，營養瓊脂培養基 30-35培養2天后觀察，玫瑰紅鈉培養基23-28培養3天后觀察。營養瓊脂培養基（細菌）玫瑰紅鈉瓊脂培養基（霉菌）金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌白色念珠菌、黑曲霉.10 以上表中所選的菌按照.2-.9重復操作。6 結果判斷 在三次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數回收率K1（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低于70%，試驗組的菌落數回收率K2(試驗組的平均菌落數減去供試品對照

13、組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率)均不低于70%。稀釋劑對照組的菌數回收率K1= 100%試驗組的菌落數回收率K2= 100%7 結論和建議此項中將根據實際測試的結果給出運行確認的結論，有異議的將給出建議。8 異常情況報告對驗證中發現的任何異常/不合格情況應按照異常情況管理規程執行。9 再驗證如該驗證的試驗方法或試驗相關試劑發生改變，需再驗證。10附件10.1附件1 培養基靈敏度檢查記錄10.2附件2 薄膜過濾法無菌檢查記錄10.3附件3 微生物方法學驗證記錄10.4附件4 培養基廠家報告附件1：培養基的靈敏度復核培養基類型： 菌落計數用培養基 名稱批號1菌懸液制備菌種名稱菌種編

14、號菌種批號培養溫度生長狀況培養時間培養箱編號金黃色葡萄球菌ATCC6538良好 不良大腸埃希氏桿菌ATCC8739良好 不良枯草芽胞桿菌ATCC6633良好 不良白色念珠菌ATCC10231良好 不良黑曲霉ATCC16404良好 不良將新鮮培養物上的菌株用0.9%氯化鈉溶液制成1ml含菌數小于50-100cfu的菌懸液；黑曲霉向培養基中加入3-5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數小于50-100cfu的孢子懸液。2觀察記錄培養溫度培養

15、箱編號培養時間對照培養基廠家配制批號加入菌株培養基簡稱：待測培養基；：對照培養基加入菌懸液名稱培養基名稱3個平皿菌落數（CFU/皿）菌落平均數（CFU/皿）菌落數/菌落數(%)金黃色葡萄球菌大腸埃希氏桿菌枯草芽胞桿菌白色念珠菌黑曲霉3評定標準：待測培養基上的微生物數量不得低于對照培養基上微生物數量的70%。結 論符合規定 不符合規定復核人： 操作人：附件2：稀釋液的無菌性檢查名稱的氯化鈉蛋白胨溶液規 格批號檢驗依據CHP2010實驗條件培養基名稱改良馬丁培養基（培養基）硫乙醇酸鹽流體培養基（培養基）配制批號培養溫度20253035取樣量實驗觀察結果觀察天數培養基樣品管培養基樣品管培養基陰性對照管培養基陰性對照管陰性陽性陰性陽性陰性陽性陰性陽性第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天第8天第9天第10天第11天第12天第13天第14天評定標準硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基均為澄清，或雖顯渾濁但經證明并非有菌生長，判供試品符合規定結 論符合規定 不符合規定 復 核 人：