1、1前言隨著工業的發展，人類活動對環境的影響越來越大，其對土壤的污染也越來 越嚴重。目前土壤與環境質量問題已成為當今全球共同關注的重大問題。其中重 金屬污染因具有隱蔽性、潛伏性、長期性、易遷移和不可逆性而尤為引人注目。 目前最引起人們關注的是汞、鎘、鉛、銘、神、銻，合稱為重金屬污染中的“六 毒”1，而鎘以毒性高、滯留時間長、生物遷移性強和易被植物吸收并積累而受 廣泛關注，但對于銻的研究進度還是有點緩慢。重金屬污染的治理方法主要包括 物理方法、化學方法和生物方法。自Brooks等1977年首先提出重金屬超累 積植物(hyper accumulator)以來，超累積植物具有強烈的吸收累積重金屬的能力

2、， 能將所吸收的重金屬元素大量遷移至植物莖葉等地上部器官中，所進行的植物修 復克服了傳統環境污染治理技術許多方面的弱點，表現了新的可用價值3，具有 治理效果的永久性、治理過程的原位性、治理成本的低廉性、環境美學的兼容性、 后期處理的簡易性、修復過程的無二次污染性、提高土壤有機質和培肥地力等優 點，因此，利用超累積植物進行的植物修復已經成為土壤重金屬污染研究和治理 的熱點囹。盡管植物修復顯示了良好的應用前景，但仍然存在許多局限性，如重 金屬超積累植物一般生物量較小、生長緩慢，極大限制了超累積植物的修復效率 5。超累積植物根際中的微生物數量巨大，活性極強，是超累積植物根際微生態 系統中最活躍的組成

3、成分在促進植物生長、提高植物生物量和土壤中重金屬的生 物有效性方面有著重要的作用6。本課題研究的實際意義：從銻污染的土壤上篩選分離出的耐重金屬的植物根 圈促生細菌(PGPR)SUD165/26，能很好的促進植物生長，在促進植物修復效 果方面有著巨大的應用潛力7。因此，日益引起致力于植物修復方面研究和治理 的人員高度關注超累積植物根際中的微生物，開發微生物一超累積植物聯合修復 技術，已成為重金屬污染土壤的植物修復研究的重要方向之一。該技術的關鍵是 尋找合適的、與超累積植物匹配的根際微生物。微生物在修復被重金屬污染的土 壤方面具有獨特的作用。本實驗通過實驗篩選分離出目標菌株，分析試驗結果， 從而進

4、一步的去研究其形態學與生理生化特性8-10。并且通過研究聯合修復技術 的使用可以在一定程度上克服使用單一的修復手段存在的缺點，提高修復效率、 降低修復成本11。國內外研究動態：中國工農業生產規模和鄉鎮城市化的快速發展，造成農田 和水資源受到工業三廢、農用化學品及飼料添加劑中金屬的污染，土壤質量和水 資源環境日趨下降。據國家環保局不完全統計，中國全國每年因重金屬污染的糧 食達1.2 x106萬kg，造成的直接經濟超過200億元，受不同程度重金屬污染的 耕地約有2000萬hm2，約占耕地總面積的1/5。中國水體重金屬污染問題也十 分突出，江河湖庫底質的污染率高達80.1%。太湖底泥中Cu、Pb、C

5、d、Sb含量 均處于輕度污染水平；黃浦江干流表層沉積物中，Cd超背景值2倍、Pb超1 倍；蘇州河中，Pb全部超標、Cd為75%超標、Hg為62.5%超標。此外，由 于礦山開采、金屬冶煉廢水排放、污水灌溉等人為因素的影響，導致重金屬污染 物在土壤和水體中累積，產出的糧食和魚蛋肉等受重金屬污染，使得農副產品的 產量和質量下降，嚴重威脅食用者健康12。從目前來看，微生物修復是最具發展 和應用前景的生物修復技術，人們在微生物材料、降解途徑以及修復技術研發等 方面取得了一定的研究進展，并展示了一些成功的修復案例13。目前在這方面研 究較多的是汞、鉛、鎘。Nakamura等(1999)研究了在汞污染Min

6、a mat海灣的沉 積物中14，在細菌的作用下，汞的揮發率提高到62.975.1%，該研究還表明， 甲基汞從土壤中的去除率也有很大提高15。但是隨著微生物修復范疇及內涵的不 斷拓展，特別是針對復雜的污染土壤生態系統，每種微生物修復技術不僅要克服 自身原有的不足，而且還需進一步認識和解決在修復過程中出現的新現象和新問 題，如新型污染物類型的發現、新微生物資源的評價、污染物的土壤修復過程與 生態/健康風險、修復技術的復合機制及高效應用等方面16-18。因此，污染土壤 的微生物修復仍面臨著極大的挑戰，任務十分艱巨。本人見解基于以上，本課題是具有現實可行性的，加入不同濃度的Sb3+溶液， 通過微生物的

7、耐重金屬性，然后分離篩選出所需的微生物菌株，既能讓我們了解 更多的耐重金屬的微生物，同時也為我們在微生物與植物的聯合修復研究當中起 到了至關重要的作用，并且讓我們對未來的發展前景充滿期待。同時植物修復技 術適用于中、低強度的大范圍污染治理，對治理現場擾動小，綠色環保，社會生 態綜合效益良好且易為公眾所接受，尤其是治理費用比傳統技術低一至幾個數量 級，并且對重金屬污染土壤的治理成效具有永久性。因此，植物修復概念提出后 很快成為環境領域的世界性、前沿熱點研究課題，普遍認為植物修復技術將成為環保領域的朝陽產業。然而，由于該項技術起步時間不長，在基礎理論、修復機 理及技術工藝方面，還需進行大量研究19

8、2材料2.1供試植物材料與污染土壤來源從朝陽校區試驗基地采集簍蒿根際土壤和簍蒿植株，用無菌紙袋帶回實驗室 分離和篩選。2.2培養基2.2.1培養基的配制LB培養基牛肉膏：3g，蛋白胨10g，NaCl 5.0g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。葡萄糖蛋白胨液體培養基：葡萄糖5.0g，蛋白胨5.0g，K2HPO4 2.0g，蒸餾 水 1000mL，pH7.0。淀粉培養基：可溶性淀粉20g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，瓊脂 18g，蒸餾水 1000mL，pH7.4。有氮培養基：蔗糖 10g，（NH4）2SO41.0g，K2HP04 2.0g，MgS04.7H20 0.5g， NaCl

9、0.1g，酵母膏 0.5g，CaCO3 0.5g，瓊脂 20g，蒸餾水 1000mL，pH7.2。檸檬酸鹽培養基：NH4H2PO4 1.0g，及 K2HPO41.0g，NaCl 5.0g，MgS04.7H20 0.2g，檸檬酸鈉2.0g，1%漠香草酚藍乙醇溶液10mL，蒸餾水1000mL，瓊脂18.0g， pH6.8。明膠培養基：蛋白胨20.0g，NaCl 5.0g，明膠180.0g，蒸餾水l000mL，pH7.6。蛋白胨水培養基：蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1000ml，pH7.6.醋酸鉛培養基：pH7.4的牛肉膏蛋白胨瓊脂100mL，硫代硫酸鈉0.25g，滅 菌后加無菌的1

10、0%醋酸鉛水溶液1mL。2.3試劑葡萄糖；可溶性淀粉;蔗糖；牛肉膏；NH4H2PO4； K2HPO4； NaCl； MgS04.7H20； 檸檬酸鈉；漠香草酚藍；95%乙醇；明膠；硫代硫酸鈉；醋酸鉛；酒精；次氯 酸鈉；蛋白胨；酵母提取物；氯化鈉；瓊脂粉；酒石酸銻鉀；鹽酸；氫氧化鈉; 蒸餾水。2.4實驗儀器LDZM立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）、電子天平（上海?？?電子天平）、凈化工作臺（蘇州華宏凈化技術有限公司）、pH計（上海儀電科學 儀器股份有限公司）。3方法3.1銻抗性菌株的分離與純化從朝陽校區試驗基地采集簍蒿根際土壤和簍蒿植株，用無菌紙袋帶回實驗 室。根際土壤和簍蒿植株經簡單處

11、理，并對所采集簍蒿的根、莖、葉用水沖洗十 凈，分別稱取1g根、莖、葉，用濃度75%的酒精和2.5%的次氯酸鈉溶液先后消 毒表面，并用無菌水浸洗數次 將表面消過毒的根、莖、葉放入無菌研缽中，加 入9mL無菌水和無菌石英砂，充分研磨。稱取根際土壤莊，加入裝有9mL無 菌水的小三角瓶中，充分振蕩混勻，采用稀釋平板法分離植物根、莖、葉內生細 菌和根際細菌，將懸液分別稀釋涂布于LB固體培養基中，28條件下培養，待 長出菌落后挑取單菌落劃線純化，獲得根際細菌10株（編號為T1- T10），根內生 細菌10株（編號為：GG|Q，莖內生細菌8株（編號為：J-J）和葉內生細菌1101 86株（編號為：YY6）。

12、轉至斜面，4 C條件下保藏。3.2銻抗性菌株的篩選在 LB 培養基中添加濃度為 0ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL 和 200ug/mL的Sb3+溶液。供試菌株用無菌牙簽點接于加入不同濃度Sb3+的培養基 中，30C培養2天，觀察其能否生長及生長情況。3.3銻抗性菌株的菌種鑒定參考細菌分類學基礎21和常見細菌系統鑒定手冊22。3.3.1菌落形態觀察LB培養基上涂布得到單菌落，觀察單菌落邊緣形狀、大小、隆起情況、表 面形態、菌落顏色、透明度等。3.3.2菌株的生理生化試驗3.3.2.1甲基紅(M.R.)試驗接種供試菌株于葡萄糖蛋白胨培養液的試管中，置于30C恒溫培養

13、24h取 出，沿管壁加入M.R.試劑3-4滴，觀察是否變色。若培養液由原來的橘黃色變 為紅色則為陽性反應。3.3.2.2乙酸甲基醇(V.P.)試驗接種供試菌株于裝有葡萄糖蛋白胨培養液的試管中置于30C恒溫培養箱培 養24h。取出培養好的試管，在培養基中加入等量的40% NaOH，再加入等量的 a-蔡酚溶液，用力振蕩，再放入37C的恒溫箱中保溫15-30min，如果培養液出 現紅色，則為陽性反應,反之為陰性反應。3.3.2.3糖發酵試驗供試菌株分別接種于碳源為葡萄糖、蔗糖、乳糖的發酵管，28C培養48h， 觀察生長情況。如指示劑漠甲酚藍(黃一紫，pH范圍5.2至6.8)變黃表示產酸為 陽性(+)

14、;不變或變藍為陰性()。3.3.2.4淀粉水解試驗供試菌株在淀粉培養基平板上劃線，28C培養48h，在平板中倒入少量 Lugol s碘液觀察菌落周圍是否有透明圈及透明圈的大小。3.3.2.5過氧化氫酶試驗抗性菌株有氮培養液中28C培養24h。用接種環取一小環涂抹于已滴有5% 過氧化氫的玻片上，產生氣泡者為陽性，無氣泡為陰性。3.3.2.6檸檬酸鹽試驗檸檬酸鹽培養基調pH 6.8,加漠香草酚藍乙醇溶液作為指示劑。配制后培養 基為黃綠色，分裝試管，121C滅菌20min。將供試菌株接入檸檬酸鹽液體培養 基中培養4天，若細菌分解檸檬酸鹽及磷酸銨產堿，則培養基pH升高，由黃綠 色變為深藍色為陽性；培養

15、基不變色為陰性。3.3.2.7明膠液化試驗供試菌株穿刺接種于明膠培養基，28C培養25天，如明膠液化為陽性， 反之為陰性。3.3.2.8吲噪試驗將菌株接種于蛋白胨水培養基中，30C培養2天，在培養基內加3-4滴乙醚， 搖動數次，靜置1-3min，待乙醚上升后，延管壁徐徐加入2滴吲哚（對二甲基氨 基苯甲醛）試劑，在乙醚和培養物之間產生紅色環狀物為陽性反應。3.3.2.9硫化氫試驗供試菌株穿刺接種于醋酸鉛培養基中，37C培養2天，培養基如果變黑為陽 性，反之為陰性203.4銻抗性菌株的產酸性試驗供試菌株接種于有氮培養基中，在30C、120 r/min，搖床振蕩培養48h后， 用pH計測定培養液的p

16、H值。4結果與分析4.1銻抗性菌株的篩選結合表1數據，可以看出：（JJ）、（GGm）、（T- T ）和Y-Y （除Y ）銻離子濃度為50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL和200ug/mL的培養基中都沒 有生長，在對照組均有生長，且長勢良好，圖1的濃度順序依次是由上到下從左 至右為 200ug/mL、150ug/mL、100ug/mL、50ug/mL 和 0ug/mL，可以看出在對照 組中，Y5的長勢是非常的好，且菌株的圓形分布也是相當的良好，在銻離子濃 度為50ug/mL和100ug/mL時，Y5菌的長勢也是非常健康的，但是有一定的減弱 了，但是當銻離子

17、濃度為150ug/mL時，Y5菌已經受到了一定的抑制，到了 200ug/mL時，Y5菌基本停止生長，從此可以看出銻對菌體有一定的毒害作用， 在銻離子濃度大于200ug/mL時完全抑制菌體的生長。由此可以看出低濃度的重 金屬長期脅迫會使土壤中微生物產生一定的適應性和抗性，高濃度的重金屬脅迫 則導致微生物種類和數量的降低，因此微生物也可以作為檢測重金屬污染的一種 指標。表1不同銻離子濃度下，細菌在LB固體培養基中的生長情況菌濃度ug/mL株050100150200Y1-Y6 （除 Y5）+Y5+JJ8+GGi。+TA+注：+表示有生長，一表示無生長圖1 Y5菌在不同銻離子濃度下的生長狀況4.2銻抗

18、性菌株的形態學鑒定從表2可以得出的Y5菌株形成的菌落為原形、透明、肉紅色、濕潤和規則 的，能夠很清晰的用肉眼觀察出來。表2 Y5菌的形態學特征項目菌株Y5形狀圓形透明度透明顏色肉紅色濕潤濕潤邊緣規則4.3銻抗性菌株的生理生化特性鑒定從表3可以看出：Y5菌株除了在甲基紅、淀粉水解、吲哚、蔗糖和乳糖中 是呈陰性反應外，其他都呈陽性反應。結合形態學特性，可初步鑒定Y5為芽孢 桿菌屬（Bacillus）o表3 Y5菌的生理生化特性項目菌株Y5甲基紅陰淀粉水解陰明膠液化陽過氧化氫酶陽硫化氫陽V.P.陽檸檬酸鹽陽吲哚陰蔗糖陰乳糖陰葡萄糖陽鑒定結果芽抱桿菌屬（Bacillus）4.4銻抗性菌株的產酸性試驗從

19、表4可以看出，菌株Y5的產酸性能比較強，查資料得知微生物對重金屬 的溶解主要是通過其代謝作用產生多重低分子量的有機酸，如甲酸、乙酸、丙酸 和丁酸等，這些酸性成分能夠促使土壤中的重金屬溶解17，由此可初步推斷Y5 菌可促進土壤中銻的溶解，在與植物聯合修復銻污染方面能夠起到一定的作用。表4 Y5菌對有氮培養基pH值的影響PH對照菌株二7.04.85結論由實驗得出的結論是：細菌在不同銻離子濃度的培養基中培養，除Y5菌之 外的其他菌種都不耐銻，并且Y5菌的產酸性也較好，但在實驗中發現，當Sb3+ 濃度為150ug/mL時Y5菌也受到了一定的抑制，當濃度超過200ug/mL其生長完 全受到抑制，最終篩選

20、得到了目標菌種Y5菌。另外通過研究其形態學和生理生 化特性，可初步鑒定出Y5細菌為芽孢桿菌屬，通過產酸性試驗得出Y5菌具有一 定的產酸性，由此可初步推斷出Y5菌在與植物聯合修復中能夠起到一定的作用。參考文獻：陳文清，侯伶龍，劉琛，等.根際微生物促進下魚腥草對鎘的富集作用J.四川大學學報，2009, 3(2): 120-124.王海鷗，徐海洋，鐘廣蓉，等.根際微生物對植物修復重金屬污染土壤作用的研究進展J.安徽農業科學,2009, 37(30): 14832-14834.郭凌.光合細菌在防治重金屬對農作物污染中的作用及機理研究D.山西大學,2007.賈瑩.接種微生物對油菜吸收土壤Cd效果的影響D.河北農業大學,2010.孫瑞波，盛下放，李婭，等.南京棲霞重金屬污染區植物富集重金屬效應及其根際微生物特性分析J. 土壤學報,2011, 9(5): 1013-1020.宋俊波，程永艷，李佳.鉛鎘脅迫下接種根際細菌和真菌對圓葉無心菜生長和鉛鎘累積的影響J.北方環境,2011, 5(5): 64-66.施曉東，常學秀，彭麗，等.微生物對藨草和白茅積累土壤重金屬的影響J.曲靖師范學院學報,2005, 5(3): 4-7.張璐.微生物強化重金屬污染土壤植物修復的研究D.湖南大學,2007.唐明燈，吳龍華，李振高，等.無色菌產酸對土壤溶液重金屬濃度及海州香薷重金屬吸收的影響J. 土壤