1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。代謝控制發酵考試試卷及答案-20032004年度生物工程專業代謝控制發酵考試試卷及答案（2004年6月）班級姓名得分名詞解釋（20分）：Catabolitrepression(2分)分解代謝物阻遏：在培養基中有多種營養物質時，微生物先選擇利用易分解利用的營養物質，而這種營養物質的分解，對分解利用其它營養物物質所需酶的合成起阻遏作用。其實質是細胞內cAMP少了。2Pasteureffect(2分)巴斯德效應：微生物細胞的有氧呼吸抑制了發酵作用。酵母發酵酒精時，由于供氧使TCA循環加快，ATP增加，細胞內能

2、荷增大，反饋抑制和阻遏EMP途徑中關鍵酶FPK酶，使酒精產量下降。3.Energycharge(2分)能荷：是細胞內能量狀態的一個認為假設參數，指細胞內含有的核苷酸中相當于ATP的數量百分比。能荷ATP1/2ADP/ATPADPAMP100%4.Concertedfeedbackinhibition協同反饋抑制：在代謝途徑中，會產生兩個以上的代謝產物，任何一種代謝產物的積累都不會對代謝途徑的第一步反應得酶起抑制作用，只有當代謝產物同時過量積累時，才會對代謝途徑的第一步反應得酶起抑制作用。5.Cooperte(synergistic)feedbackinhibition增效性反饋抑制：在代謝途徑

3、中，每種代謝產物只能單獨地、部分地抑制第一步反應的酶。當它們均過量積累時，對反應第一步酶起強烈的抑制作用。此時，抑制作用大于兩種代謝產物單獨抑制作用之和。6.Metabolicinterlock代謝互鎖：在代謝途徑中，前端反應的酶受到與其看似無關的代謝產物的抑制（阻遏）作用。7.Analogue-resistentmutant抗代謝結構類似物突變株：對于代謝產物的結構類似物的抗性突變株。代謝產物對代謝途徑有抑制（阻遏作用），使其酶不能合成，而代謝結構類似物存在時，與代謝產物結構類似，起相同作用，使反應的酶無法合成，但結構類似物并不減少（因為它不參與蛋白質代謝）。其抗性菌株就是在代謝結構類似物存

4、在的情況下，仍能合成代謝產物，使產物大量積累。8.Antigencarrierlipid(ACL)抗原載體脂(antigencarrierlipid)簡稱ACL。它是細菌萜醇，其結構式為：含有11個異戊二烯單位的醇。ACL存在于細胞膜上，它的長長的非極性烴鏈插在脂肪質雙分子層的非極性區，而分子的極性末端（磷酸根一端）則是游離狀態，作為細胞質水相中的多糖裝配單位的受體，并且象手臂一樣把它共價結合著，已在細菌胞膜內側形成的多糖單位轉運到膜的外面，組成肽聚糖脂多糖等細胞表層的聚糖復合物。9.Preferencedsynthsis2、優先合成與平衡合成cabABCDEFG優先合成：代謝途徑中，產生E,

5、G兩種代謝產物。酶a的活性大于酶b。所以優先合成E。E積累后，酶a活性受抑制，C流向G，G積累后又抑制了酶c。填空（10分）每空白點2.5分。在下列營養條件下填寫E.coli的乳酸操縱子的表達方式：當無葡萄糖、細胞cAMP水平高、又無乳糖時，不表達。當無葡萄糖、細胞cAMP水平高、有乳糖時，大量表達。當有葡萄糖、細胞cAMP水平高、又無乳糖時，不表達。當有葡萄糖、細胞cAMP水平高、有乳糖時，少量表達。畫圖并簡述（30分）1、原核生物細胞和真核生物細胞代謝調節的部位。（6分）圖21原核微生物細胞的代謝調節部位（模式圖）1-可溶性營養物質或代謝產物的跨膜傳送2-代謝途徑的酶催化作用3-酶和載體蛋

6、白的合成圖22真核微生物細胞的代謝調節部位1-可溶性營養物質或代謝產物的跨膜傳送2-代謝途徑的酶的催化3-核中進行的轉錄4-細胞質中進行的翻譯5-細胞內溶質的跨膜傳送2、阿拉伯糖對E.coli利用阿拉伯糖的酶系合成的誘導機制（10分）圖2-12阿拉伯糖對ara操縱子araC位點的調控作用當大腸桿菌細胞以阿拉伯糖作為生長所需碳源和能源時，它們產生三種將阿拉伯糖轉化為木酮糖的酶。321L-AraL-RuL-Ru-5-eqoac(,P)D-Xu-5-eqoac(,P)1L-阿拉伯糖異構酶2核酮糖酸酶35-eqoac(,P)核酮糖差向異構酶它們分別是三個基因（B.A.D）編碼的產物。這三個基因在E.c

7、oli中是屬于阿拉伯糖操縱子中的一個基因簇，稱為araB.A.D，另外兩個基因araE和araF位于基因簇araB.A.D遠離的地方，負責阿拉伯糖的跨膜運輸的，araE編碼一種膜蛋白，araF編碼一種位于細胞壁與細胞膜之間的阿拉伯糖結合蛋白。與araB.A.D相鄰的是一個復合的啟動子區和一個調節基因araC，這個調節基因的性質和我們前邊介紹Lac.operon中的調節基因性質全然不同。araC的蛋白同時顯示正、負調節因子的功能。3、普通酶和變構酶反應動力學性質的不同。（6分）圖2-32變構酶的典型動力學曲線ATCase的反應動力學曲線如下：eqoac(,1)Asp和CTP對ATCase酶的激活

8、和抑制作用從S形曲線上可知，都有一個閾值，即Asp濃度超過某個閾值時才顯示抑制作用。eqoac(,2)隨Asp濃度的增加，ATC酶與底物的親和力協同性增大。eqoac(,3)半飽和（飽和速度的一半）所需底物濃度因CTP的存在而增加。eqoac(,4)CTP能抑制ATC酶活性，但不能全部抑制，增加Asp濃度可以恢復酶的全部活力，這說明CTP與底物是分別與酶結合，而不是競爭同一個活性中心。eqoac(,5)底物濃度飽和而達到最大反應速度Vmax時，不受抑制劑的影響，即當顯著提高底物濃度時，看不到抑制作用。簡述細菌二元調節系統（信號傳導）如何調控基因表達？（8分）eqoac(,1)位于細胞質膜上的傳

9、感蛋白（sensorprotein）該蛋白質具有激酶活性，又稱傳感激酶。eqoac(,2)應答調節蛋白（responseregulatorprotein）位于細胞質中。傳感激酶在與膜外環境的信號反應過程中本身磷酸化，磷酰基因被轉移到應答調節蛋白上。磷酸化的應答調節蛋白即成為阻遏蛋白，該阻遏蛋白再通過操縱子的阻遏作用進行調節控制結構基因的轉錄。請論述和回答（40分）如果你分離到一株啤酒酵母，其生長速率是已知生產菌株的二倍，因此你將其用于生產酒精的試驗，但結果表明，該酵母菌株發酵葡萄糖的產物是酒精和其他產物的混合物，并且酒精的產量只有現有生產菌株的50%。請你根據本課程所學過的知識、并結合微生物學

10、、微生物遺傳學等有關知識，簡要寫出你將打算如何改進你新分離酵母菌株，使其優于現有的生產菌株的方案？（10分）答：呼吸抑制發酵在低糖0.2%酵母比生長速率0.1/h時，還是進行呼吸和生長的，而使其生長速率大大提高，因此可以篩選呼吸缺陷型突變株。分離獲得的啤酒酵母活化接一環，30培養24h，5mL酵母完全培養基YEPD30，16h，5mL酵母完全培養基YEPD，對數生長期1mL適當稀釋100個菌落/平板0.1mLYEPD溴化乙吖啶黃2030g/mL處理，致死率達99%，突變頻率為10-3左右YEPD平板上挑選小酵母菌落含有三苯基四氮唑鹽（TTC）和YEPD平板上挑選白色小菌落（正常的和呼吸強的酵母

11、菌，因有細胞色素酶可還原TTC使菌落變紅，而呼吸缺陷型突變株，不能還原TTC使菌落不變色為白色）含甘油培養基平板上（不長），YEPD平板（長出菌落）再進行酒精發酵挑選高產菌株論述代謝控制發酵的基本思想（路）。（10分）答：(1)黑曲霉生物合成檸檬酸機制圖3-11黑曲霉自蔗糖生物合成檸檬酸代謝調節圖（2）代謝控制育種eqoac(,1)耐高糖、耐高濃度葡萄糖、a-脫氧葡萄糖R。eqoac(,2)耐高檸檬酸且不利用檸檬酸。eqoac(,3)抗Mn、Zn、Fe等金屬離子的突變株。eqoac(,4)抗SHAMr突變株，增加倒呼吸鏈解除高濃度的ATP的PFK反饋抑制。eqoac(,5)在葡萄糖為唯一碳源上

12、孢子長得少的HMP代謝流減弱。eqoac(,6)挑選形成菌球體系多而小的突變株。eqoac(,7)耐高溫突變株。（3）發酵條件eqoac(,1)溫度35370Ceqoac(,2)嚴格控制培養基中的Mn、Zn、Fe，我國的菌株是金屬離子抗性突變株，無需控制。eqoac(,3)控制低P。eqoac(,4)氮源、蛋白質量控制在0.45%,適量補充(NH4)2SO4eqoac(,5)控制前期長菌pH4.0左右,后期產酸pH2.0以下。eqoac(,6)溶解氧要高（溶氧分壓90%滿足率）試設計篩選高產L-賴氨酸的科研方案（包括出發菌株的選擇、生物合成途徑的調節機制、遺傳標記的篩選、發酵條件的控制等）。（

13、20分）答：1.切斷或減弱支路代謝切斷支路代謝，Hom-或Met-+Thr-。（北微所AS1.299-Hom-As1563,1568,2.5%;上微所黃色短桿菌2305-Hom-H-2,3%;日本黃色短桿菌No2247-Hom-H1013,4.2%）變換優先合成NTG降低HD酶活性eqoac(,1)增強代謝流轉向合成Lyseqoac(,2)Hom減少，Thr合成減少，解降Thr+Lys的協同反饋抑制。例：日本.黃色短桿菌No2247獲得一批Thrs,Mets突變株，其中一株所產25g/L（2.5%），此突變株HD僅為野生菌株的1/30。這樣低的HD酶比活性下，不添加Thr和Met也能生長，但若

14、單獨過量添加一種Thr和Met，反而由于過剩的Thr或Met能以致或阻遏本來活力已經很低的HD，使Thr和Met合成不足而抑制生長，即呈現Thrs或Mets2.解除反饋調節選育抗結構類似物突變株Lys的結構類似物：S-2氨基乙基-L-半胱氨酸（簡稱AEC），-氯己內酰胺（CCL）,-氟己內酰胺（FCL）,苯酯基Lys（CBL）,甲基賴氨酸（ML），-氨基月桂基內酰胺（ALL）,青霉素，桿菌素等。Thr的結構類似物：-氨基-羥基戊酸（AHr）,鄰甲基蘇氨酸（OMT）等Leu結構類似物：-噻唑丙氨酸（-TA）等(1)解除AK酶的反饋調節ThrHxr、Allr、AECr、LysHxr、AHVr、ML

15、r、CCLr、CBLr等。(2)解除PS酶的代謝調節解除代謝互鎖eqoac(,1)Leu-Naa-Leuleqoac(,2)S-Leur2-TarLeuHxreqoac(,3)苯醌s、喹啉s是Leu合成酶（或某酶）抑制劑3.增加前體Asp反饋抑制（調節）并不意味著完全阻止合成反應，通過受控制反應物的底物積累能拮抗性地克服這種抑制，關鍵酶AK所催化的底物Asp，AK酶的反應速度與底物Asp濃度間的關系曲線呈S型，隨著Asp的增多，AK酶和Asp親和力協同性的增大，根據變構酶S型動力學性質，存在底物對反應速度發生影響的閾值，Asp既是反應底物，又是反應的激活劑，必須控制在閾值以上。當濃度飽和而達到

16、最大反應速度時，就不在受反饋抑制，因此為了高產Lys應設法增加前體物Asp濃度以抵消抑制物的影響。（1）選育丙氨酸（Ala-）缺陷（2）選育Asp結構類似物抗性，AspHxr（3）設法增強PC酶活性eqoac(,1)采用200-500g生物素/mL激活PC酶eqoac(,2)選擇在琥珀酸為唯一碳源生長快速的突變株。FPseqoac(,3)選擇丙酮酸激酶缺陷FPseqoac(,4)檸檬酸合成酶活性降低eqoac(,5)用乙酰CoA激活PC酶（因為乙酰CoA與Asp之間存在平衡合成）eqoac(,6)采用低糖（4-5%）添加方法可激活PC酶（4）設法增加（強化）Glu的反饋控制，使Glu優先合成4

17、.選育溫度敏感突變株選育溫度敏感突變株也應是Lys發酵代謝控制育種的有效途徑。其突變位置發生在亮氨酸合成酶系，高絲氨酸脫氫酶或丙酮酸-L-氨基酸轉氨酶編碼的基因中，均有利于積累Lys。缺陷型。日本戶扳修等人，以乳糖發酵短桿菌AJll082(AECR+CCLR+A1a-)為出發菌株，30下250g/mLMNNG誘變處理30分鐘，分離選育30下生長良好，而在34不能生長的溫度敏感突變株乳糖發酵短桿菌AJll093(AECR+CCLR+A1a-+tems)。同法從已獲得谷氨酸棒桿菌AJ109043株(AECR+A1a-)誘變選育AJl099(AECR+A1a-+tems)，這兩株菌都是34以上高溫培

18、養時表現為Leu-，添加2.5mg/mLLeu可恢復正常生長，使用此兩株溫度敏感突變株29-30培養，發酵24-48小時期間將溫度提高到34以上，抑制菌體多余生長，并解除了Leu對PS酶的反饋阻遏，解除代謝互鎖，結果兩株菌分別積累賴氨酸45g/L和39g/L，對糖轉化率分別為45和39。5.Lys生產菌株的定向選育標記以谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、北京棒桿菌、鈍齒棒桿菌等Glu生產菌株為出發菌，通過誘變定向選育獲得遺傳標記應為：Hom-+A1a-+AECR+CCLR+CBLR+AspHxR+Leu-+TAR+Thr-+Met-+tems例如：乳糖發酵短桿菌AJ11274Lys菌株選育過程如下乳糖

19、發酵短桿菌AJ1511野生型產Lys0AJ3445AECR產Lys11.6g/LAJ3424AECR+A1a-產Lys33g/LAJ3796AECR+A1a-+CCLR產Lys39g/LAJ3991AECR+A1a-+CCLR+MLR產Lys43g/LAJ11274AECR+A1a-+CCLR+MLR+FPs產Lys48g/L（四）細胞融合選育高產Lys菌株蛋白胨1%、酵母1%NaCl0.5%、蔗糖0.5%PH7.0、31.5Glu產生菌AJ11638DECr（德夸香素）KMr（酮丙二酸r）LogphasecellALys產生菌AJ11082（低葡萄糖消耗速率）AECr、CLLr、MLr、FPs、L-Ala-LogphasecellB0.3g/mLPenicilian（31，90分鐘）Centrifugation收集菌體，高滲洗滌后，懸浮于高滲溶液中300g/mLLysozyme（31.5靜止21h）ProtoplantAProtoplantB等量混合centrifugationResuspensioninhypertonicsolution（pH10.5,0.1MCaCl2）33%PEG6000+0.1MCaCl處理36，15min進行融合，融合反應液離心后，收集