1、 高效液相色譜法High performance liquid chromatographyHPLC格物致知，厚德載物HPLC和經典液相色譜無本質區別 概 述經典液相色譜高效液相色譜常壓或減壓填料顆粒大柱效低分析速度慢色譜柱只用一次不能在線檢測高壓，4050MPa填料顆粒小，250m柱效高,4000060000塊/m分析速度快色譜柱可重復多次使用能在線檢測101-2概 述氣相色譜高效液相色譜只能分析揮發性物質（20%）不能用于熱不穩定物質的分析用毛細管色譜可得很高的柱效有很靈敏的檢測器如ECD和較靈敏的通用檢測器FID和TCD流動相為氣體，無毒，易處理運行和操作容易儀器制造難度較小幾乎可以分析

2、各種物質可用于熱不穩定物的分析色譜柱不能很長，柱效不是很高高靈敏的通用檢測器少流動相有毒，費用較高運行和操作比GC難一些儀器制造難度大蒸發激光光散射檢測器ELSD是靈敏度較高的通用檢測器101-3一、HPLC的主要類型按固定相分子聚集狀態分：LLC和LSC四種基本類型色譜法分配色譜法partition chromatography吸附色譜法adsorption chromatography離子交換色譜法 IEC空間排阻色譜法SEC18.1 HPLC主要類型和原理除此以外，還有如下類型的現代色譜分析法101-4化學鍵合相色譜法 BPC（最常見類型） banded phase chromatogr

3、aphy正相BPC：反相BPC：離子抑制色譜法ISC ion supression chromatography離子對色譜法PIC paired ion chromatography 親和色譜法AC affinity chromatography手性色譜法CC chiral chromatography膠束色譜法MC micellarchromatography電色譜法EC electro chromatography101-5（一）化學鍵合相（bonded phase , BP）定義：經化學反應將官能團鍵合在載體表面得到的固定相。種類：非極性、弱極性、極性 非極性鍵合相：主要用于反相色譜在硅

4、膠的表面鍵合上非極性的烴基，如碳十八（C18 ,ODS,最常用）、辛烷基（C8）、甲基（C1）、苯基等制得。烷基的鏈長度對溶質的保留、選擇性和載樣量有很大的影響，鏈長度增加，穩定性好， k 增大，載樣量增大，分離選擇性提高。二、化學鍵合相色譜法101-6 弱極性鍵合相 一般有醚基和二羥基鍵合相，應用很少。 極性鍵合相：一般用于正相色譜的固定相氰基鍵合相：鍵合氰乙硅烷基 Si(CH2)2 CN質子接受體，分離選擇性與硅膠相似，與雙鍵化合物可發生選擇性作用。對雙鍵異構體及含雙鍵數不同的環狀化合物具有較好分離能力。氨基鍵合相：鍵合氨丙硅烷基Si(CH2)3 NH2兼有氫鍵接受和給予兩種功能，對多官能

5、團化合物具有很好的分離選擇性。因此，可用于分離糖類化合物。但不適合于分離帶羰基的物質。101-7硅膠鍵合相種類示意圖101-8制備通過鍵合反應制備：主要為硅氧烷型鍵合相，是通過硅膠和氯硅烷進行烷基化反應制得，如ODS的鍵合反應如下：R為氯時，可進一步通過硅氧烷鍵鍵合烷基101-9性質和特點（1）化學鍵合相的性質含碳量：代表鍵合量，以含碳百分數表示。表面覆蓋度：已反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例。封尾（end-capping）：在鍵合反應后，用三甲基氯硅烷等進行鈍化處理，減少殘余硅醇基。目的是：增加穩定性，減弱吸附性101-10（2）化學鍵合相的特點：使用過程中不流失化學穩定性好適于梯

6、度洗脫載樣量大（3）鍵合相使用注意事項：在規定的酸堿范圍內使用：一般pH28，擴展柱可達pH 211。否則引起硅膠溶解。不同廠家、批號的同類型色譜柱表現不盡相同。101-111、概述：定義：以化學鍵合相為固定相的色譜法。地位：在HPLC中占重要地位，應用：幾乎適于所有類型化合物，應用最廣泛。特點：均一穩定； 不易流失，使用周期長； 柱效高； 重現性好； 鍵合相種類多，分離選擇性高機制：尚不明確統一分類：正相鍵合相色譜，NP-BPC 反相鍵合相色譜，RP-BPC（二）化學鍵合相色譜法（BPC）101-12固定相：極性鍵合相，如氰基柱、氨基柱。流動相：非極性或弱極性溶劑（烷烴+極性調節劑）應用于：

7、極性至中等極性化合物的分離；分離機制：分配、吸附或兼而有之。保留與分離的規律：極性強的組分， k 大，后洗脫出柱；流動相極性增強，洗脫能力增大，使組分 k 減小，tR 減小，反之則反。2、正相鍵合相色譜法NP-BPC101-13（1）固定相：非極性鍵合相，如C18柱、C8柱（2）流動相：極性大的溶劑甲醇-水、乙腈-水常用有時加入少量弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制劑，可減少殘余硅醇基的作用 （3）應用：極性至非極性化合物的分離，占80%（4）分離機制：無統一定論。吸附與分配：爭論疏溶劑理論：比較有說服力雙保留機制等計量置換理論：全新理論體系，似乎更科學3、RP-BPC101-14非極性與極性相互

8、排斥形成多個“空腔” 。保留機制：組分與極性溶劑分子間的排斥力，使溶質分子與鍵合相的烴基發生疏水締合。（不是色散力）洗脫機制：組分極性部分受到極性流動相的作用會離開鍵合相，產生解締合作用。兩種作用交替使不同組分tR不同，得以分離。疏溶劑理論簡介（solvophobic theory）101-15（5）保留行為的主要影響因素： 組分的分子結構：極性，疏水性，k，tR 流動相：在RP-BPC中，流動相表面張力和介電常數：影響很大 表面張力介電常數 極性 k tR流動相pH：調節pH可抑制有機弱酸、弱堿的離解，從而增加其與固定相的疏水締合作用，使 k 變大，達到分離目的。這種BPC稱為離子抑制色譜法

9、ISC。ISC適合于 3pKa7的弱酸 ；7pKa8的弱堿 固定相：鍵合烷基碳鏈越長、鍵合濃度越大， 疏水性，k 101-16（1）原理：把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子與離子對試劑的反離子生成不帶電的中性離子對，增加了溶質與非極性固定相之間的作用，使 k 增大，分離效果增加。模型如下：4、反相離子對色譜法（PIC或IPC）paired ion chromatography101-17（2）影響因素：離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質的 k 增大；在一定范圍內試劑的濃度升高，溶質的k增大 流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的 k 值最大固定相 、

10、流動相的性質：同一般RP-HPLC（3）適用范圍：有機酸、堿、鹽，離子型和非離子型化合物的混合物。酸類或帶負電荷物質：用季銨鹽堿類或帶正電荷物質：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽101-18101-19液相色譜分離類型選擇參考表相對分子質量1000相對分子質量1000不溶于水排阻色譜，非水流動相溶于水排阻色譜，水為流動相同系物 分配色譜不溶于水異構體 吸附色譜樣 品分子大小差異 排阻色譜溶于水，不離解排阻色譜，水為流動相反相液液色譜堿 陽離子交換色譜溶于水，全離解酸 陰離子交換色譜溶于水，可離解 反相離子對色譜 101-20三、其他HPLC法（自學）親合色譜法（affinity chromatograph

11、y；AC）手性色譜法（chiral chromatography；CC）膠束色譜法（micellar chromatography；MC）電色譜法（electrochromatography；EC）101-21手性色譜法的手性固定相CSP101-22親和色譜PAC固定相生物色譜101-24一、固定相1、HPLC對固定相的要求：顆粒細且均勻：以減小渦流擴散項；傳質快：以提高分析速度；機械強度高：以保證能耐受高壓；化學惰性：以保證穩定性和不與組分及流動相發生反應。18.2 HPLC的固定相、流動相及其選擇101-252、高效液相色譜的主要固定相 化學鍵合相基質重點：化學鍵合相固定相101-26二、

12、HPLC的流動相1、HPLC流動相的基本要求：不與固定相發生化學反應；對試樣有適宜的溶解度；k一般在110之間，在25之間最佳；必須與檢測器相適應；如使用UVD時，選用截止波長小于檢測波長的溶劑；純度要高，粘度要小。純凈，一般選用色譜醇試劑，并需事先過濾、 脫氣。101-272、流動相對分離效果的影響由色譜分離方程式可知： n 由固定相類型、填充質量及柱長等因素決定 主要受溶劑種類的影響 k 受溶劑配比的影響因此，應根據溶劑的強度和選擇性不同來選擇合適的溶劑類型和配比。101-283、溶劑的強度和選擇性溶劑的洗脫能力即溶劑強度，直接與其極性相關正相色譜中：溶劑極性越大，洗脫能力越強；反相色譜中

13、：溶劑極性越小，洗脫能力越強； 例：水的極性比甲醇強，在正相色譜中，水的洗脫能力強于甲醇，但在反相色譜中，甲醇的洗脫能力強于水。如何描述溶劑的極性和強度？ 溶劑極性的描述有多種方法，但Snyder提出的溶劑極性參數（Polarity parameter）最為實用。101-29組分、溶劑、固定相三者之間的相互作用主要以分子間作用力為主，組分的分配系數由三者的分子間作用力決定。Snyder將溶劑劃分為三種作用力類型參考物乙醇二氧六環硝基甲烷溶劑作用力類型質子受體Xe質子給予體Xd強偶極力Xn101-30極性參數 P：以三個參考物為基準，測定計算極性參數PPlg(Kg)elg (Kg)dlg(Kg)

14、n(Kg)e， (Kg)d，(Kg)n分別為三種典型溶劑作用力的極性分配系數(羅氏系數)p越大，極性越強，在正相色譜中的洗脫能力越強；101-31101-32強度因子S：常在反相鍵合相色譜中表示溶劑的強度正相色譜中水的洗脫能力最大p10.2；而在反相色譜中水的洗脫能力最小 S0101-33混合溶劑的強度： 正相洗脫，多元混合溶劑的強度用極性參數表示： 反相洗脫，多元混合溶劑系統的溶劑強度因子：P 純溶劑極性參數純溶劑體積分數101-34溶劑的選擇性：Snyder以溶劑和溶質間的作用力作為溶劑選擇性分類的依據，將選擇性參數定義為：上式各項，分別反映溶劑的質子接受能力、質子給予能力和偶極作用力根據

15、其相似性，將溶劑分成8組，得到溶劑選擇性分類三角形101-35八 組溶劑101-36溶劑選擇性三角形 S S T101-374、流動相最優化方法簡介： 高效液相色譜實際工作中流動相的選擇是十分關鍵的技術，選擇出合適的條件及選擇所用的時間代表著選擇者的經驗與水平。簡單試樣可由常用的洗脫溶劑及經驗確定；復雜試樣 “色譜專家系統”選擇最佳條件。101-38（1）流動相優化的目的： 確立色譜優化指標，以此來評價色譜分離的質量和預測優化的可能方向。一般所確立的優化指標應滿足于以下目的： 實現最難分離物質在理想分離前提下的快速分離：即針對復雜樣品中某一組分的分離與分析 實現最大整體分離效能前提下的快速分離

16、：即針對復雜樣品中全部組分的分離與分析。101-39（2）流動相優化的方法：兩大類：解析法和半解析法：代表方法為窗口圖解法混合液設計統計技術黑箱法：以“單純型法”為代表101-40混合液設計統計技術具體步驟如下： 據Snyder溶劑選擇性分組，選擇具有顯著性差異的溶劑：反相色譜以洗脫強度最弱的水為底劑，選用甲醇、乙腈或四氫呋喃，配制成混合溶劑；正相色譜以己烷或戊烷為底劑，常選用乙醚、氯仿、二氯甲烷等，制成混和溶劑。101-41以其中一種溶劑與底劑組成的二元溶劑系統進行試驗，調整溶劑配比，使組分的 k 值在110之間(最好在25之間)，然后用混合溶劑的強度公式求出溶劑強度：例：溶劑為40%甲醇水

17、溶液，其強度系數為: 根據表20-5的數據，可知 S1 = S水水 S甲醇甲醇 = 03.0 0.4 = 1.2101-42 計算并確定具有等洗脫強度的另外兩個二元溶劑系統：溶劑、溶劑 乙腈=(1.20)/3.2=0.375，即37.5%乙腈水溶液 四氫呋喃=(1.20)/4.5=0.267，即26.7%THF水溶液101-43 以洗脫強度相等而選擇性不同的溶劑為溶劑選擇三角形的三個頂點ABC。在ABC各點的洗脫強度均相等。由此三角形可求得各點的溶劑組成比例。101-44如溶劑由50A和50B組成，具體配比為： 甲醇0.40.5=0.2 乙腈0.3750.5=0.187 水10.20.1870

18、.613通過上述方法可在三角形內任一點獲得四元溶劑流動相。每種流動相對一個確定的試樣可提供一個特定的分離選擇性。101-45 從圖中選擇710 個流動相進行分離實驗，以色譜優化指標對圖譜進行結果分析，找到最佳的流動相。101-46一、HPLC的速率理論1、渦流擴散相：A=2dp，為降低A值，采用小顆粒固定相，一般310m，目前多用5m，并采用球形、粒度均勻（RSD5%）。2、縱向擴散相：B2Dm，Dm與流動相的粘度成反比，與溫度成正比。因此，HPLC不同于GC，一般在最佳流速以上時，該項很小，可以忽略。18.3 分離條件的選擇101-483、傳質阻抗相：固定相傳質阻抗Cs：BPC中鍵合相多為單

19、分子層，即厚度可忽略，所以固定相的Cs可以忽略。流動相傳質阻抗Cm ： 產生：因為流路中心的組分分子還未來得及擴散進入流動相和固定相界面，就被m 帶走，使色譜峰展寬。Cm=mdp2/Dm m 是由色譜柱和填充情況決定的因子。101-49靜態流動相傳質阻抗Csm： 產生：由于固定相的多孔性，使部分流動相滯留在固定相的微孔內，而流動相要與固定相進行質量交換，必須先擴散到微孔內。當固定相的微孔多且又深又小時，傳質阻抗就越大，使峰擴展也就嚴重。 Csm與dp2成正比，與分子在流動相中的擴散系數成反比。綜上，HPLC的Van Deemter 方程為：H A + Cmu + Csmu101-50實驗條件選

20、擇，即降低H，提高n的原則是：選擇細顆粒的流動相，粒度均勻、球形可降低流動相的傳質阻抗和渦流擴散相。降低流動相的粘度，因為DmT/，實驗中常使用甲醇和乙腈，而很少使用乙醇。流動相的流速不宜過高，以防柱效降低。分析型HPLC一般流速為1.0ml/min左右。柱溫一般不宜太高，以防縱向擴散。 101-51二、正相鍵合相色譜法的分離條件： S：氰基、氨基等極性鍵合相 m：烷烴加適量極性調節劑三、反相鍵合相色譜法的分離條件： S：常用非極性化學鍵合相，如ODS的應用非常普遍，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。此外，苯基鍵合相常用于分離芳香化合物及多羥基化合物，如黃酮苷類。 m：使用ODS時，常使

21、用水為基礎溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調節劑，選擇適當的比例。101-52流動相pH：可選擇弱酸、弱堿或緩沖鹽作為抑制劑，調節流動相的pH，抑制組分的離解，提高分離效果。一般pH應在28之間，防止破壞ODS。流動相中加入緩沖鹽：0.1%1%的醋酸鹽、磷酸鹽等，可以減弱固定相表面殘余硅醇基的干擾作用，減少峰的拖尾，改善分離效果。101-5318.4 高效液相色譜儀高效液相色譜儀由 高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統、記錄系統 等五大部分組成。 動畫鏈接101-55儲液瓶托盤在線脫氣機高壓輸液泵自動進樣器檢測器101-56包括： 溶劑貯存器、脫氣機、高壓泵、梯度洗脫裝置、管線和壓力表等1、溶

22、劑貯存器：一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為12 L。一、高壓輸液系統101-57注意事項一必須遵守：所有試劑和樣品必須經過嚴格的過濾目的：對色譜柱、儀器起到保護作用，消除由于污染對分析結果的影響。原因：色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。101-58樣品 、溶劑過濾方法：濾膜： 0.45m水相濾膜、有機相濾膜101-592、真空脫氣機：標準脫氣機5ml/min 排液6min以上。微型脫氣機2ml/min 排液5min101-60流動相

23、使用前必須進行脫氣。原因如下：除去溶解的氣體，以防止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析；溶解的氧氣會導致樣品中某些組份被氧化；柱中固定相發生降解而改變柱的分離性能；若用FLD，可能會造成熒光猝滅。注意事項二101-61常用的脫氣方法 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續吹氦脫氣，效果較好，但成本高。加熱回流法：效果較好，但操作復雜，且有毒性揮發污染。抽真空脫氣法：易抽走有機相。超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩1015min，此法效果最差。在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫氣

24、機利用膜滲透技術 在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯101-623、高壓輸液泵： 高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關鍵部件之一，其功能是 將溶劑貯存器中的流動相以高壓形式連續不斷地送入液路系統，使樣品在色譜柱中完成分離過程。對泵的要求：輸出壓力高（可達400kg/cm2）、流量范圍大（分析型：0.110ml/min；制備型：可達100ml以上）、流量恒定、無脈動，流量精度和重復性為0.5%左右。此外，還應耐腐蝕，密封性好。按其性質可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。101-63柱塞式往復泵：恒流泵常采用這種結構，如動畫： 101-64四元泵工作原理示意圖101-65注意事項三要特別注意

25、泵的維護：HPLC的心臟基本要求：穩定、無脈動、流量準確流動相使用前請必須脫氣、過濾。使用緩沖鹽時，要加在線Seal-wash選項，以異丙醇等清洗泵頭。關機前，反相色譜柱用 100%的水沖洗系統20分鐘，然后用有機溶劑沖洗系統10分鐘（如甲醇）；正相色譜柱用適當的溶劑沖洗。然后關泵。101-67相關操作結束后應進行及時清洗101-68不要超過規定的最高壓力，及時更換Purge Valve內的過濾芯。（當打開Purge Valve時壓力高于10bar，表明濾芯已堵）不要超過規定的最高壓力。使用合適密封圈。流動相不能含有任何腐蝕性的成分。泵工作時防止流動相用完而空吸。101-69逆時針打開清洗閥順

26、時針關閉清洗閥毛細管出口,流向進樣器溶劑由此廢液管流向廢液瓶清洗閥 Purge Valve的使用逆時針旋轉打開清洗閥，清洗閥打開時，液體從廢液管中流出，為清洗狀態。更換溶劑后，打開清洗閥，設置:流量5ml/min，沖洗510min。順時針旋緊清洗閥為關閉狀態,此時流動相由毛細管流向進樣器101-704、梯度洗脫裝置梯度洗脫：使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值或離子強度相應地變化，達到提高分離效果，縮短分析時間的目的。梯度洗脫裝置分為兩類：一類是外梯度裝置（又稱低壓梯度）：流動相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統。另一類是內梯度裝置

27、（又稱高壓梯度）：將兩種溶劑分別用泵增壓后，按電器部件設置的程序，注入梯度混合室混合，再輸至柱系統。101-71梯度洗脫的實質：是通過不斷地變化流動相的強度，調整混合樣品中各組分的 k 值，使所有譜帶都以最佳平均 k 值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質 k 值的變化是通過溶質的極性、pH值和離子強度來實現的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達到。101-72實例展示101-73進樣系統包括進樣口、注射器和進樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進行分離。常用：六通閥，結構同GC部分；自動進樣器。二、進樣系統101-74六通閥10

28、1-75101-761、構成：分離系統包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱為不銹鋼，內徑26mm，柱長10 50cm。三、分離系統2、性能指標：色譜柱使用一段時間后，應在一定的條件下考察以下的性能指標：柱壓、H、n、fs、k、及R。101-77色譜柱性能考察常用試樣和流動相:硅膠柱：試樣：苯、萘和聯苯流動相：己烷或庚烷烴基鍵合相柱：試樣：尿嘧啶、硝基苯、奈和芴為流動相：甲醇-水(85:15)或乙腈-水(60:40)或者，試樣：用苯、奈和苯磺酸鈉流動相：甲醇-水（80：20） 101-78四、檢測系統 （動畫鏈接）液相色譜儀的關鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復性好、線性范圍寬、死

29、體積小、對溫度和流量的變化不敏感。在液相色譜中，有兩種類型的檢測器：專用型檢測器，它僅對被分離組分特性有響應。屬于此類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等；通用型檢測器，它對一般溶質有響應。屬于此類檢測器有蒸發光檢測器、示差折光檢測器等。常見檢測器的性能指標：參見表185101-791、紫外檢測器（UVD）：原理同UV，吸收池換為流通池可進行在線分析。DADVWD主要有三種：可變波長VWD多波長MWD二極管陣列DAD101-80101-81101-822、熒光檢測器（fluoreeenscence detector;FD）測定原理同熒光分析法，F = 2.3KI0 ECl 。應用于測定能產生熒光的物質。Q-量子產率，K-熒光收集效率101-833、電化學檢測器（electrochemical detector; ECD）包括極譜、庫侖、安培和電導檢測器等，其中安培檢測器應用最廣泛，主要用于測定具有氧化-還原特性的化合物，其靈敏度高，適于測定痕量組分。101-84原理：柱流出液與氮氣或空氣混合成小液滴，蒸發除去流動相獲得組分氣溶膠，進入散射室產生散射光。散射光強度（I）與溶膠組分的質量（m）關系： I = k mb 或 lg I = b lgm + lgkk 和b 為與蒸發室溫度、霧化氣體壓力