1、宏基因(jyn)組學在基因(jyn)發現中的應用 何佳2015.1共二十二頁Contents宏基因組學簡介1研究方法及應用2在基因發現過程中的應用3展望4共二十二頁一、宏基因組學簡介(jin ji)宏基因組學（Metagenomics）又叫微生物環境基因組學、元基因組學其主要含義是：對特定環境中全部微生物的總DNA（也稱宏基因組，metagenomic）進行克隆，并通過構建宏基因組文庫和篩選等手段獲得新的生理活性物質；或者根據(gnj)rDNA數據庫設計引物，通過系統學分析獲得該環境中微生物的遺傳多樣性和分子生態學信息共二十二頁為什么要研究(ynji)宏基因組學？在自然條件下,微生物廣泛參與、

2、和等重要元素的循環轉化(zhunhu),并在人體的食物消化、毒素降解及機體免疫反應、環境污染物降解等方面發揮著重要作用微生物通過其群落而非單一個體來執行這些重要功能,而目前人們對微生物的認識主要基于實驗室純培養的單一微生物物種,對微生物群落作為整體的功能的認識遠遠落后于對其個體的認識共二十二頁二、研究方法(fngf)及應用研究方法以基因組測序技術為依托主要程序：1、從環境樣品 (例如土壤 )中直接提取 DNA; 2、將 DNA克隆到合適的載體中;3、將載體轉化到宿主細菌建立(jinl)環境基因組文庫;4、對得到的環境基因組文庫進行分析和篩選 共二十二頁環境(hunjng)樣品富集培養(piyn

3、g)DNA提取小片段插入質粒載體大片段插入柯斯BAC等載體宏基新組文庫構建序列分析法功能分析法底物誘導法直接裂解法細胞分離提取法插入寄主（大腸桿菌、鏈霉菌、假單胞菌）文庫篩選宏基因組文庫構建與篩選流程示意圖：共二十二頁宏基因組學的應用(yngyng)：16SrDNA文庫(wnk)微生物多樣性分析宏基因組水平基因轉移的分析未培養生物單細胞基因組的基因構成傳感微生物細胞之間的相互作用基因組文庫構建及新型生物技術的應用新型代謝途徑中原位擴增識別宏基因組學共二十二頁三、在基因(jyn)發現過程中的應用宏基因組文庫的篩選方法是新基因發現的一種新策略基因組文庫的構建是揭示新基因的前提，如何有效地利用文庫中

4、豐富的資源,挖掘新的生物(shngw)分子是關鍵由于環境基因組的高度復雜性,需要通過高通量和高靈敏度的方法來篩選和鑒定文庫中的有用基因共二十二頁第1類基基于克隆子的特殊代謝活性(功能驅動)第2類于核酸序列差異分析(序列驅動)第3類基于底物誘導基因的表達第4類基于包括(boku)穩定性同位素和熒光原位雜交在內的其它技術.篩選技術大致(dzh)可分為4類:共二十二頁1、功能(gngnng)分析法以活性測定為基礎 ,通過建立和優化合適的方法從基因組文庫中獲得具有特殊功能的克隆依賴于功能基因或編碼功能蛋白在外源宿主中的表達 能夠在各種( zhn)選擇性平板上通過可見性狀篩選的到產生脂酶、淀粉酶、七葉苷

5、水解酶、甘油脫水酶及抗菌活性的克隆子共二十二頁方法一：對具有特殊功能的克隆子進行直接檢測 ；方法二：基于異源基因的宿主(szh)菌株與其突變體在 選擇性條件下功能互補生長的特性進行 共二十二頁2、序列(xli)分析法根據已知的基因和基因表達產物的保守序列設計引物和探針，通過雜交(zjio)或PCR擴增鑒定出已知基因的同源物,進而篩選陽性克隆子對鑒定新的基因成員有一定的局限性 ,但它已被有效地用于鑒定系統發育學中的標志基因(如 16S rRNA基因 )和帶有高度保守域的酶基因(如聚酮化合物合成酶、葡萄糖酸還原酶和腈水合酶等 ) 共二十二頁2.1 隨機(su j)鳥槍法（Shotgun seque

6、ncing） 將一條完整的目標序列(xli)隨機打斷成小的片段 ,分別測序 ,然后利用計算機根據序列(xli)間的重疊關系進行排序和重新組裝, 并確定它們在基因組中的正確位置 。共二十二頁優點：為篩選新的天然產物提供了一種可選擇的途徑, 從中挖掘上百萬個新基因,揭示不可培養(piyng)微生物的代謝途徑.缺點：耗費大,需大量人力和物力；與個體微生物基因相比,對序列片段進行分析則極為困難。共二十二頁2.2 焦磷酸測序( Pyrosequencing) 焦磷酸測序技術是在焦磷酸鹽測序法的基礎上結合一種乳膠材料和皮升級反應孔 ,將基因組 DNA進行隨機切割 ,批量地進行整個測序反應，能夠在相同的時間

7、內破譯 6 106組以上的基因組序列(xli) ,比 Sanger法要快100倍 ,提高了測序的效率。共二十二頁由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。原理：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的(md)。焦磷酸測序技術的反應體系由反應底物、待測單鏈、測序引物和4種酶構成。反應底物為5-磷酰硫酸、熒光素。焦磷酸測序技術的特點(tdin)及原理：共二十二頁測序過程(guchng): 脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)

8、 DNA聚合酶（能和DNA模板的下一個堿基配對） 添加到測序引物的3末端 （釋放） 焦磷酸(PPi) ATP硫酸化酶加入 APS 特異的檢測峰 （微弱光檢測） ATP氧化熒光(ynggung)素（產生可見） 加入熒光素共二十二頁3、底物(d w)誘導基因表達法第一步：以 p18GFP為載體構建宏基因組文庫；第二步：在無底物情況下以異丙基 2D硫代半乳糖苷 基因 ( gfp)表達的克隆子； 第三步：在培養基中添加底物誘導代謝關基因的表達；第四步：根據 gfp基因的表達從宏基因克隆庫中篩選出表 達代謝基因的克隆子 ,利用熒光激活細胞分離(fnl)儀 ( FACS)從瓊脂培養平板上將GFP表達的克隆

9、子分 離出來。共二十二頁4、穩定性同位素標記技術 通過 SIP實驗使參與特定代謝過程 (例如甲烷氧化 )的生物基因組富集 ,克隆從 SIP實驗中獲得的13C標記的核酸 ,從而構建一個因吸收了特定的基質而在環境中執行特定代謝功能的微生物宏基因組文庫 .這極大地減少(jinsho)了需要篩選的克隆數量.通過實驗直接克隆13-并在一個較小的克隆文庫中獲取目的基因也是可行的共二十二頁四、展望(zhnwng)從宏基因組文庫中獲得新編碼基因是該技術的主要功能所在,已發現(fxin)的新基因主要有生物催化劑基因、抗素抗性基因以及編碼轉運蛋白基因方法上仍存在著多方面有待解決的問題,比如在基因組提取和純化方面,

10、針對不同的樣品并沒有統一的方法，載體和宿主的選擇也是文庫能否構建成功的關鍵分子生物芯片技術是頗受歡迎的一種高通量篩選方法,而且其效率很高,準確率也能令人信服,但是其成本也是我們不能不考慮的問題。針對在宏基因組文庫構建過程中出現的瓶頸,仍需要不斷的更深入的研究共二十二頁thank you ！請老師(losh)及同學批評指正共二十二頁內容摘要宏基因組學在基因發現中的應用。宏基因組學（Metagenomics）又叫微生物環境基因組學、元基因組學。其主要含義是：對特定環境中全部微生物的總DNA（也稱宏基因組，metagenomic）進行克隆，并通過構建宏基因組文庫和篩選等手段獲得(hud)新的生理活性物質。宏基因組文庫的篩選方法