1、實驗一花粉搜集、貯藏及花粉生活力測定一、實驗目的把握鮮花粉搜集、儲藏的方式及原理。觀看花粉在人工配制的培育基上的萌生情形，熟悉花粉萌生形成花粉管的 外形和伸長進程，為明白得植物的生殖進程奠定基礎。二、實驗原理花期不遇，給雜交工作造成困難，有的樹木和園林植物可通過延長花期解決， 有的不能不進行花粉儲藏，花粉貯藏對某些園林植物雜交育種具有重要的意義。 通過花粉貯藏，它能夠使一些遲開花的園林植物和早開花的園林植物進行雜交， 或到較遠的地址給母本授粉，花粉的貯藏與運輸能夠打破雜交育種中雙親時刻上 和空間上的隔離，擴大育種的范圍。花粉在貯藏期間的穩固性，與花粉壁外層（外壁）的性質和貯藏期間花粉原 生質的

2、代謝有關。在貯藏期間代謝調較少可溶性糖類和有機酸的花粉能夠在較長 期間維持其活力。花粉貯藏的原理在于制造必然的條件，使花粉降低代謝強度， 延長花粉的壽命。花粉壽命的長短，因植物種類不同而異。在自然條件下，大多 數植物的花粉從花藥散出后只能存活幾小時，幾天或幾個禮拜。如一樣木本植物 花粉壽命很長，如在干燥涼爽的條件下，柑桔花粉能存活4050d，椴樹45d， 蘋果1070d，櫻桃30100d，麻棟一年，葉培忠教授實驗發覺杉木的花粉可存 活17年之久；而在草本植物中，如棉屬花粉采下后24h存活只有65%，超過24h 很少存活；多數禾本科植物的存活時刻不超過一天，如玉米12d，水稻花粉在 田間條件下3

3、min就有50%喪失生活力，5min后幾乎全數死亡，是壽命最短的例 子。一樣在自然條件下自花授粉植物花粉壽命比常異花、異花授粉植物為短。花 粉的類型和生活力也表現了相關性，通常三胞花粉的壽命要比二胞花粉短，如水 稻等禾本科植物為三胞花粉，壽命都是比較短的。花粉壽命的長短除上述因種遺傳性的不同之外，還與溫度、濕度有緊密的關 系。通常高溫高濕下花粉呼吸旺盛，會專門快失去生命力，但在極干燥的條件下， 花粉失去水分，也無益于保留。據亞達姆斯實驗，蘋果花粉在干燥狀態下，可保 留3個月；如放在28C，濕度80%的條件下，通過5個禮拜即失去生活力。 維霍夫實驗中，丁香的花粉貯藏在干燥器中，15d以后發芽率降

4、到50% ；至20d 時，僅有個別花粉發芽；030d時，即全數死亡。因此，臨時不用的花粉，應當 即在適宜的條件下貯藏，妥帖保留。為維持花粉生活力那么人為采取減低其代謝 強度，維持其純潔性，將其貯存于低溫、干燥、黑暗，并較為穩固的環境條件下， 以維持其活力。最近幾年來，在貯藏花粉方面利用超低溫（-192C的液態空氣或 -196C的液氮）、真空或降低氧分壓和快速冷凍干燥等方式，延長花粉生活力取 得良好的成效及應用。了解花粉的生活力關于農林生產和育種工作具有重要意義。在生產和雜交工 作中需要進行的人工輔助授粉的雜交授粉，都需要搜集和貯藏具有生活力的花 粉，花粉的生活力除受植物本身的遺傳決定外，同時受

5、環境阻礙。不同來源的花 粉生活力高低存在專門大不同，花粉生活力的大小是保證雜交成功的關健。在有 性雜交育種中，常因父母本花期的不同，作為父本的花粉必需通過貯藏直到母本 植株開花時在植株開花時在用于授粉；為了幸免雜交工作失誤，在利用遠地寄來 的花粉或一段時刻儲藏的花粉之前，必需對花粉生命力進行鑒定，以便對雜交 功效進行分析與研究。通常花粉的形態、花粉中酶的活性和積存淀粉（淀粉質花粉）的多少與花粉 生活力緊密相關，因此能夠利用花粉的形態觀看，過氧化物酶、脫氫酶的活性高 低，淀粉的含量和在人工培育基上花粉管萌生的情形作為確信花粉生活力高低的 標準。三、實驗材料、要緊試劑及儀器（一）各類園林植物花粉如

6、榆葉梅百合、牡丹、鳳仙花、柳樹、菊花、月季、紫茉莉等植物的花粉（二）要緊儀器載玻片、蓋玻片、凹玻片、解剖針、毛筆、棉球、干燥器、硫酸紙級硫酸紙 袋、曲別針、小指形管、標簽、標記筆、顯微鏡、脫脂棉、花粉篩、冰箱、顯微 鏡、恒溫溫箱、瓷盤、鑷子、培育皿、玻璃棒、玻璃鉛筆、凡士林（三）要緊試劑硫酸H2SO4 （相對密度）、無水氯化鈣、硅膠、碘一碘化鉀、氯化三苯基四 氮唑、聯苯胺:-萘酚、Na HPO2HO、KH PO、蔗糖或葡萄糖溶液、H BO、Ca2422433（NO3）2、MgSO4、KNO3、酒精、碳酸鈉、過氧化氫四、實驗方式與步驟（一）搜集花粉選擇健壯的植株上正常的花朵，在開花前一天套硫酸紙

7、袋，下口用曲別針別 好以避免混入其他花粉，第二天花藥開裂后搜集花粉;或搜集開花前一天的花粉， 第二天進行必要的加溫處置，使花藥開裂后搜集花粉;或搜集開花前一天的花蕾， 第二天進行必要的加溫處置，使花藥開裂后搜集花粉。注意必然要搜集花藥開裂 前后的新鮮花粉，對不成熟的幼嫩花藥的花粉，成熟過頭的花粉被雨露粘濕的花 粉，有疑問的花粉基雜質要除去。（二）干燥及貯藏花粉搜集后置于清潔的環境，以避免菌類侵入引發發霉阻礙生命力，并及時 干燥，可放在散光下晾十、陰干或放入盛有CaCl （HSO、硅膠、醋酸鉀飽和液、224NaOH等）的干燥器中干燥，一樣以花粉由彼此粘結至極易分散象水一樣不粘玻 璃壁為度，用花粉

8、篩篩去雜質，依照利用的次數將其分裝于數個指形管中，幸免 因啟封而使溫度、濕度劇變造成花粉生活力銳減。一樣以1/5或更少為宜，管口 用脫脂棉塞好，活用雙層的干凈紗布扎好，有利于氣體互換和過濾氣體，貼好標 簽，說明植物品種名稱、搜集日期、地址、貯藏條件（濕、溫條件）即統一編號。 然后放入無水氯化鈣或不同濃度的H2SO4操縱的必然濕度的干燥器中，最后把十 燥器置于02，C或0C以下的冰箱中貯存。同時設對照，在室內自然溫度、濕度及陽光條件下，個一按時刻進行花粉生 活力測定，比較其不同性。（三）花粉生活力測定鑒定花粉生活力的方式有很多，歸納起來不外以下幾種：一是將待測花粉直 接授粉，最后計算結實數和結籽

9、數；二是將花粉授到柱頭上，隔一按時刻切下柱 頭，在顯微鏡下觀看花粉萌生情形，測定萌生率；三是形態觀看；四是染色觀看； 五是在人工培育基上播種花粉，觀看萌生率。以后三種為主介紹花粉生活力測定 的具體方式。一樣把具有品種典型性的花粉（指具有該品種花粉粒的大小、形態色澤等） 作為具有生活力的花粉，把小型的、皺癟的、畸形的作為無生活力的花粉。形態觀看的具體方式是：第一將花粉置于載玻片上，在顯微鏡下查看5個視 野，要求被檢查的花粉粒總數達100粒以上，計算正常花粉粒占總數的比率。此 法簡便易行，但準確性差，通常只用于測定新鮮花粉的生活力。（1）碘一碘化鉀染色法。先稱取碘和碘化鉀溶于100ml的蒸餾水中，

10、即成 碘一碘化鉀溶液。取少量花粉振播到用棉球擦凈的一般載玻片上，然后加水一滴， 使花粉散開，再加一滴碘一碘化鉀溶液，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀看不同的 5個視野，凡花粉粒被染成藍色的表示具有生活力，呈黃褐色為缺少生活力的花 粉（遇碘變藍是淀粉的特性）。（2）氯化三苯基四氮唑（TTC）法。凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用中 都有氧化還原作用，而無生活力的花粉那么無此反映，因此當TTC滲入有生活力 的花粉時其脫氫酶在催化去氫進程中與TTC結合，是污水的TTC變成TTF而成紅 色。磷酸鹽緩沖液的配置:在100ml的蒸餾水中溶解的Na HPO2H O和的KH PO， 24224調整pH值為。TTC溶液

11、配置：取的TTC溶解于10ml磷酸緩沖液中，放于棕色瓶中，置 于暗處。取少量花粉于凹玻片的凹槽內或直接放于一般載玻片上，滴入TTC溶 液一兩滴，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，將此片置于3540C下1520min， 在顯微鏡下觀看不同的5個視野，反被染成紅色的均為有生活力的花粉。（3）-萘酚法配制藥液聯苯胺溶于100ml的50%的乙醇中，盛入棕色瓶中，放暗處備用。-萘酚溶于100ml的乙醇中，盛入棕色瓶中，放暗處備用。碳酸鈉溶于100ml蒸餾水中，盛入白色瓶中備用。將以上三種溶液等量混合，即成“甲液”，盛如棕色瓶中。將3%過氧化氫，臨用前用蒸餾水稀釋成%溶液，即成“乙液”，隨配隨用。制片取花粉少量

12、，撒入凹型載玻片的凹點內，滴入“甲液”，片刻后在滴入“乙 液”，35min后，在顯微鏡下觀看不同的5個視野。凡有生活力的花粉為紅色 或玫瑰紅色。黃色的(不著色的)，為無生活力的花粉。此法受花粉萌生的培育基限制。假設有適宜的培育基能精準測定出具有生活 力并能夠萌生的花粉粒的個數，還能看到花粉粒發芽的真實情形。懸滴液發芽法把供試花粉播種在必然濃度的培育液液面上，使其花粉真實地發芽，以測定 生活力高低的一種方式。培育液一樣都是用蔗糖或葡萄糖溶液，濃度因物種而不 同，不同專門大。糖液濃度高低是為了調劑培育基的滲透壓，避免供試的花粉在 溶液中發生破裂。適合多數園林植物花粉的發芽，通用培育基配方如下：蔗糖

13、 10%加 H BO 100mg/L，Ca(NO ) 2300mg/L，MgSO 200 mg/L，KNO 100 mg/L，333 243可配成母液，歷時稀釋，母液放在冰箱中保留。具體操作方式：配制10%蔗糖溶液，滴一滴于凹玻片上，取少量花粉置于 滴液中，用大頭針攪拌均勻，然后將凹玻片放在培育皿加蓋放到20-25C溫箱中。 加蓋2h后花粉即開始萌生，24h后在顯微鏡下檢查發芽花粉的百分率。不同物 種的花粉發芽所需的時刻不同，如牡丹花粉用15%蔗糖溶液在室溫條件下，接 種后一小時即可觀看。花粉發芽檢查在低倍鏡下進行，花粉的長度為花粉粒直 徑2倍以上才算發芽，一倍以上者算萌芽。培育基發芽法培育基

14、的制備：在250ml的燒杯中加入90ml蒸餾水，再加入1g的瓊脂， 在酒精燈上加熱，使之完全溶解，然后加入定量蔗糖，制成不同濃度(5%、10%、 15%、20%)的蔗糖瓊脂培育基(分組加，每組制成一個濃度)，為了避免水分蒸 發，配制加熱的燒杯應加蓋。先把水在酒精燈或電爐上加熱煮開，倒入瓊脂，使之融化，然后倒入蔗糖， 用玻璃棒不斷攪拌，呈透明狀即可。為維持培育的濃度，可在燒杯上液面處貼上 紙條或用玻璃鉛筆沿液面劃線標記，當液面在熬制進程中因水分蒸發下降時應及 時添加蒸餾水，以維持液面的穩固和培育基的標準濃度，并將熬制好的培育基溶 液連同燒杯放入盛有35C熱水的容器中，避免冷卻凝固，以備隨后利用，

15、即配 成5%濃度的培育基。同法配成10%、15%、20%濃度的培育基。用品消毒：發芽實驗時所用的載玻片、凹玻片、鑷子等都要在消毒柜中消 毒或在100C條件下煮沸20min，冷卻后掏出用酒精棉球擦干放在大培育皿中備 用，通過消毒過的載玻片利歷時要盡可能減少和手指接觸的面積，以減少污染。花粉的播種與檢查：用玻璃棒蘸取培育基溶液，當即滴一滴于蓋玻片的中 央（直徑），使成為一表面完整的球面（球面越薄越好，不然透光性差，阻礙在 顯微鏡下觀看），當凝固后再進行花粉的播種。播種花粉時，用通過酒精消毒過的發絲蘸取花粉（假設所用花粉為陳花粉或 過于干燥的花粉時，可在播種前掏出一部份在濕氣大的培育皿中密閉15-3

16、0min 后在行播種），輕輕震動（風媒花）或涂抹（蟲媒花）在培育基表面。一要注意 發絲不能過重地接觸培育基表面，幸免破壞培育基的表面；二是要注意花粉的散 布要松散、均勻，不能密集成堆，；三要注意適宜的播種數量。體會證明，花粉 太稀，阻礙發芽，播種太稠也阻礙發芽，一樣情形下，一個顯微鏡視野以散布 20-50粒花粉為宜。播好后將蓋玻片翻轉，置于載玻片上的小玻璃環上，小玻璃 環上下涂上凡士林，環內加1第水用于保濕。濕室密封后，應在載玻片上用玻璃鉛筆標號，并進行記錄，記錄內容包括花 粉種類、培育基的糖液濃度、采粉時刻，播種時刻、濕室中滴水的多少。然后全 組集中放在一個大的瓷盤中，用紗布覆蓋后加蓋，放于15-25C的溫箱內24h后 進行檢查。若是時刻許諾，最好播后每隔2-3h檢查一次，直至花粉粒發芽數再 也不增加為止，記載花粉發芽數，以明確不同花粉的發芽的速度和發芽進程。牡 丹花粉接種后1h即可觀看。花粉發芽檢查在低倍鏡下進行，花粉的長度為花粉 粒直徑2倍以上算發芽，一倍以上者算萌芽。每片應觀看5個視野花粉數很多于 100粒以上，計算發芽率，此法每人做3片，選發芽情形最好的一片進行發芽情 形的檢查。五、試探題詳細記載花粉搜集及貯存的日期、花粉名稱、花粉搜集方式及進程、花粉 貯藏方式。通過實驗總結所搜集貯藏的花粉種類的特點。用染色法計算花粉生活力（5個視野）。用發芽法計算花粉生活