1、生物產(chǎn)品工藝品第八章 血液代用品第八章 血液代用品8.1 概述8.2 全氟碳人工血液8.3 血紅蛋白類血液代用品8.4 血液代用品的發(fā)展前景8.1 概述血液的結(jié)構(gòu) 由細(xì)胞成分和非細(xì)胞成分組成。 細(xì)胞成分：紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板 非細(xì)胞成分：稱為血漿，其中又包括膠體成分和晶體成分。 血液血細(xì)胞紅細(xì)胞白細(xì)胞血小板血漿 (細(xì)胞間質(zhì))水血漿蛋白、糖、維生素、激素、代謝產(chǎn)物及無(wú)機(jī)鹽等常規(guī)輸血的憂患 輸血時(shí)必須血型相配，延誤治療而造成死亡； 血液污染嚴(yán)重，威脅輸血安全； 健康供血人群不足，血液嚴(yán)重短缺； 血液的保存期短。 8.1 概述血液代用品定義 指具有攜帶氧擴(kuò)容功能的溶液，即除了可用于失血補(bǔ)充和出血休

2、克的復(fù)蘇外，在臨床上還可用于血液稀釋等。8.1 概述人工血液代用品特點(diǎn)（1）安全，應(yīng)無(wú)毒、無(wú)致病原、無(wú)污染、無(wú)免疫原性；（2）適合各種血型；（3）與人血液所有組分具有良好生物相容性，最大限度的替代人血的生理功能, （具備運(yùn)輸氧、二氧化碳的能力，提供緩沖和自由基淬滅能力，可起到血漿擴(kuò)容作用并維持膠體滲透壓)；（4）在血管內(nèi)有滿意的保留時(shí)間，代謝產(chǎn)物無(wú)毒并能經(jīng)正常渠道排出；（5）貯存時(shí)間長(zhǎng)而所需條件低。 8.2 血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能； 影響血紅蛋白氧親和力的因素。Hb的組成與結(jié)構(gòu)Hb4條珠蛋白鏈：1412；1462 （共574個(gè)AA） 4分子血紅素每條多肽鏈結(jié)合一個(gè)血紅素分子

3、構(gòu)成一個(gè)Hb單位 Hb是四聚體，在紅細(xì)胞中占干重的95Hb的組成8.2 血紅蛋白結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)部分為珠蛋白（globin）、輔基為亞鐵血紅素(heme) 珠蛋白是由4條肽鏈組成，包括和亞基，形成22四聚體；血紅素輔基位于表面孔穴內(nèi)，每個(gè)亞基一個(gè)；在4個(gè)亞基間有一中央孔穴: 2,3-二磷酸甘油酸（ 2,3-DPG)位于其中，穩(wěn)定了脫氧血紅蛋白的結(jié)構(gòu), O2位于其中，穩(wěn)定了氧合血紅蛋白的結(jié)構(gòu)。血紅蛋白兩個(gè)肽鏈兩個(gè)一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點(diǎn)：血紅蛋白功能 血紅蛋白在紅細(xì)胞內(nèi)能結(jié)合氧或釋放氧；

4、在肺部與氧結(jié)合形成氧和血紅蛋白（HbO2），轉(zhuǎn)運(yùn)到全身各組織并釋放出氧。 將產(chǎn)生的二氧化碳以碳酸鹽的形式從組織中運(yùn)出，從而完成肺和組織間O2和CO2的交換。血紅蛋白 對(duì)氧的親和力氧解離曲線 圖8-2 氧解離曲線P50血紅蛋白 對(duì)氧的親和力機(jī)制Hb的變構(gòu)效應(yīng) 波爾效應(yīng) 2，3-DPG的影響 影響血氧親和力的因素H+和CO2濃度增加促進(jìn)氧分子的釋放(快速)Hb(H+ ) +4O2 Hb（O2）4+H+Hb(CO2)n +4O2 Hb（O2）4+nCO2 2，3-DPG作為別構(gòu)效應(yīng)物降低脫氧血紅蛋白對(duì)氧的親和力。（代謝生成，反應(yīng)較慢）Hb-2,3-DPG +4O2 Hb（O2）4+2,3-DPG都是

5、通過(guò)改變血紅蛋白的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)血氧親和力。血紅蛋白氧解離曲線CO2pHDPG溫度CO2pHDPG溫度8.3 血液代用品的類型 無(wú)載氧功能的血管擴(kuò)容劑（第一代紅細(xì)胞代用）； 全氟碳化合物、化學(xué)修飾血紅蛋白及基因重組血紅蛋白（第 二代血紅蛋白代用品）； 模擬天然紅細(xì)胞膜和紅細(xì)胞內(nèi)的生理環(huán)境，用仿生高分子材 料將血紅蛋白包裹起來(lái)，制備成“人工紅細(xì)胞”。（第三代血 液代用品）8.3.1 全氟碳人工血液概念 是一種具有載氧功能的人造血，是將碳?xì)浠衔镏械臍湓尤坑煞哟妫纬傻念惌h(huán)狀或直鏈狀有機(jī)化合物。種類 全氟萘烷、全氟三丙胺、全氟三丁胺應(yīng)用 用于急性貧血血液極端稀釋時(shí)，以維持機(jī)體組織的供氧，為輸血

6、爭(zhēng)取時(shí)間。全氟碳化合物全氟萘烷全氟碳人工血液優(yōu)點(diǎn) 無(wú)抗原性、無(wú)毒性；不依賴于過(guò)期或其它動(dòng)物的血液，易于大量生產(chǎn)；純度易于控制。 缺點(diǎn)（1）只是氧的溶解劑，使用時(shí)患者必須呼吸足夠的氧氣才可保證氧氣溶解量；（2）循環(huán)時(shí)間短，高濃度使用可使血液粘度升高；（3）存放需要合適的溫度和條件；（4）流感樣癥狀。 8.3.2血紅蛋白類血液代用品 天然血紅蛋白； 血紅蛋白類血液代用品； 1）血紅蛋白的制備； 2）血紅蛋白的化學(xué)修飾。天然血紅蛋白（SFHS） 定義 是一種直接用紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物來(lái)作為血液代用品，用過(guò)期的血液來(lái)制造，去除了基質(zhì)磷脂，是一種非細(xì)胞攜氧物質(zhì)。 又稱為無(wú)基質(zhì)血紅蛋白。 天然血紅蛋白（SFHS

7、）優(yōu)點(diǎn) 來(lái)源廣泛、符合人體生理需要； 無(wú)需進(jìn)行交叉驗(yàn)血、能去除病原、能長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 比全氟碳化合物更符合人體生理需要，來(lái)源廣泛；8.3.2血紅蛋白類血液代用品 血紅蛋白的制備樣品處理粗分離純化純度鑒定1.樣品處理：蛋白質(zhì)提取和分離步驟操作過(guò)程可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來(lái)分離血紅蛋白(1)紅細(xì)胞的洗滌:洗滌目的: 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過(guò)少。洗滌操作：1、采集血樣。2、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離

8、心（低速短時(shí)間）6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒(méi)有黃色，表明洗滌干凈。初次離心后的結(jié)果次洗滌后的結(jié)果(2)血紅蛋白的釋放： 加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液： 過(guò)程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。分離：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏

9、斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。(4)透析： 過(guò)程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。透析過(guò)程動(dòng)畫演示利用透析袋透析裝配好的凝膠柱凝膠分離純化注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。收集得到的純化后的蛋白無(wú)基質(zhì)血紅蛋白（ SFH) 1）因SFH在血漿中很快從四聚體分解為二聚體或單體，易于通過(guò)腎臟，故其半衰期過(guò)短，僅2h-4h左右； 2)SH

10、F失去了2，3-DPG類物質(zhì)的變構(gòu)作用，其氧親和力明顯升高(氧離曲線P50下降)，故不利于向組織細(xì)胞釋放氧；3)因SFH可濾過(guò)至腎小管管腔，而高濃度的蛋白類物質(zhì)可引起管腔堵塞，導(dǎo)致腎功能受損；4)SFH具有膠體性質(zhì)，在血漿中可產(chǎn)生膠體滲透壓(COP)，在其血漿濃度與全血相同時(shí)，COP可達(dá)全血的2倍，故在常規(guī)應(yīng)用時(shí)，其濃度最高只能在7 g； (5)Hb易氧化成高鐵Hb(MetHb)，失去攜氧能力并產(chǎn)生自由基。血紅蛋白類血液代用品 血紅蛋白的化學(xué)修飾 目的： 穩(wěn)定血紅蛋白4聚體結(jié)構(gòu)，增加蛋 白相對(duì)分子量，以達(dá)到降低毒性 的作用。原理： 表面有許多可修飾的功能基團(tuán)類型：分子內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白、多聚血紅蛋

11、 白、共軛血紅蛋白、脂質(zhì)體包封血 紅蛋白；基因重組血紅蛋白圖8-3 血紅蛋白的修飾方法8.3.3 化學(xué)修飾血紅蛋白（第二代血液代用品）方法交聯(lián)血紅蛋白 聚合血紅蛋白 共軛連接血紅蛋白分子內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白血紅蛋白的化學(xué)修飾 血紅蛋白肽鏈間的交聯(lián)，降低氧的親和力。試劑：含有負(fù)電基團(tuán)并能結(jié)合在血紅蛋白中心 腔位置，如雙阿司匹林類化合物（3， 5-二溴水楊基雙延胡索酸酯），吡哆醛 類化合物。產(chǎn)品：美國(guó)Baxter公司的DCLHb、加拿大 Hemosol公司的Hemolink分子內(nèi)交聯(lián)磷酸吡哆醛(PLP)是2，3-DPG的結(jié)構(gòu)類似物，可使Hb 亞基的氨基端Val吡哆醛化；與Hb 亞基的2,3-DPG結(jié)合位

12、點(diǎn)形成共價(jià)鍵可以降低氧親和力；但由此形成的四聚體不穩(wěn)定。為了克服PLP的缺點(diǎn)。人們后來(lái)合成了含有2個(gè)吡哆醛的雙醛基衍生物，降低天然Hb的氧親合力并阻止其解聚。雙阿司匹林交聯(lián)（DCL-Hb)3，5-二溴水楊酸在與琥珀酸或延胡索酸連接后形成雙阿司匹林(DBBF)，成為血紅蛋白賴氨酸的氨基共價(jià)交聯(lián)的碳橋。DBBF對(duì)脫氧血紅蛋白修飾效果較好，為-交聯(lián)，可產(chǎn)生一種穩(wěn)定的、高協(xié)同性和低氧親和力的雙阿司匹林交聯(lián)Hb(DCL-Hb)，其功能特征與人血液很相似，DCLHb血紅蛋白的化學(xué)修飾不少于97的聚合體的分子量為65kD一130kD， 低于5的聚合體分子量小于65kD。 臨床：患者出現(xiàn)皮膚黃染、無(wú)癥狀血尿、

13、腸梗 阻發(fā)生率顯著提高，三期臨床死亡率增加，于 1999年終止臨床試驗(yàn)。Hemolink血紅蛋白的化學(xué)修飾 O-棉籽糖交聯(lián)血紅蛋白，由各種相對(duì)分子量的 聚合、非聚合成分組成，含交聯(lián)Hb大于95%。 臨床：三期已在美國(guó)、英國(guó)和加拿大開(kāi)展。不良 反應(yīng)是血壓升高，但在48-72小時(shí)內(nèi)恢復(fù)對(duì)肝腎功 能無(wú)影響。多聚血紅蛋白血紅蛋白的化學(xué)修飾在分子內(nèi)交聯(lián)的基礎(chǔ)上采用交聯(lián)劑使血紅蛋白分子之間聚合形成較大的分子； 交聯(lián)劑主要有戊二醛、乙醇醛、糖醛等。與血紅蛋白反應(yīng)時(shí)無(wú)特異 的結(jié)合位點(diǎn)，屬于多位點(diǎn)修 飾，形成形成26個(gè)四聚體的聚合物。減少溶液中分子數(shù)目，溶液滲透壓和黏度也隨之降低，半衰期延長(zhǎng)。多聚血紅蛋白采用戊

14、二醛多聚化牛Hb,產(chǎn)品：美國(guó)Biopure公司的Hemopure,被許可用于臨床。市場(chǎng)定價(jià)：800美元/200ml。Northfield Laboratories公司生產(chǎn)的Polyheme；戊二醛聚合人血紅蛋白，在制備過(guò)程中去除了大部分未聚合血紅蛋白，消除了大部分不良反應(yīng)；缺點(diǎn)：原材料匱乏。共軛連接血紅蛋白將Hb四聚體與生物兼容性良好、能在血液循環(huán)系統(tǒng)中長(zhǎng)時(shí)間停留的大分子相互連接;加大Hb的分子量，穩(wěn)定四聚體的結(jié)構(gòu)。采用的共軛物有聚氧乙烯（POE）、單甲氧聚氧乙烯(MPOE)、葡聚糖多聚糖類似物、聚乙二醇(PEG)等。大分子聚合物包裹在Hb周圍的高分子鏈覆蓋了抗原位點(diǎn)，起到了降低免疫原性。化學(xué)

15、修飾存在的問(wèn)題血紅蛋白的化學(xué)修飾 產(chǎn)品是非均一性混合物； 病原微生物尚未解決； 大分子的聚合體引起輕微腎毒性，引起血小板減少和白細(xì)胞減少癥等副作用； 終產(chǎn)物不穩(wěn)定性，導(dǎo)致交聯(lián)Hb間的重新排列； 重現(xiàn)率低，多聚體的多聚化會(huì)增加氧親和力并降低四聚體間協(xié)同作用。8.3.4 脂質(zhì)體包封血紅蛋白（第三代紅細(xì)胞代用品）思路：仿造天然紅細(xì)胞，制作“人工紅細(xì)胞”將高濃度的Hb包在脂質(zhì)體內(nèi),包裹于膜內(nèi)的Hb的四聚體不易解聚，因而載氧能力大，循環(huán)半衰期長(zhǎng)，副作用小。采用磷脂制成雙分子層膜，加入膽固醇增加膜的韌性和穩(wěn)定性，加入2，3-DPG降低Hb的氧親和力，加入VE防止Hb的氧化。 脂質(zhì)體包封血紅蛋白血紅蛋白的化

16、學(xué)修飾制備的兩個(gè)基本條件： 1）制備過(guò)程中確保極易被氧化的血紅蛋白不被氧化； 2）脂質(zhì)體包封血紅蛋白及其輔助成分在制備和保存過(guò)程中有足夠的穩(wěn)定性，并使脂質(zhì)體包封血紅蛋白的循環(huán)存留時(shí)間延長(zhǎng)。工藝發(fā)展脂質(zhì)體包封血紅蛋白工藝的發(fā)展血紅蛋白的化學(xué)修飾第一代脂質(zhì)體：從雞蛋、大豆中提取的不飽和脂肪酸、膽固醇以及維生素E等造成：1）半衰期短；2）不飽和脂質(zhì)在血漿中的氧化使血紅蛋白被氧化成高鐵血紅蛋白。第二代脂質(zhì)體：長(zhǎng)鏈飽和磷脂（氫化大豆卵磷脂），延長(zhǎng)半衰期，降低了脂質(zhì)過(guò)氧化，但存在溶血磷脂等雜質(zhì)。后來(lái)改為使用高純度的合成二硬脂酰卵磷脂，但磷脂雙層與血紅蛋白相互作用，引起血小板活化因子濃度升高。脂質(zhì)體包封血紅

17、蛋血紅蛋白的化學(xué)修飾第三代：第二代脂質(zhì)體包封血紅蛋白和凍干保存方法相結(jié)合。用海藻糖或蔗糖做凍干保護(hù)劑，可在長(zhǎng)期保存中保持脂質(zhì)體包封血紅蛋白形態(tài)穩(wěn)定，達(dá)到“即用型”血液替代品的目標(biāo)。 日本研制的NRC（Terumo公司-泰爾茂 )主要不良反應(yīng)是被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬，抑制網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能，使機(jī)體免疫功能受損，易引起感染性休克等。生產(chǎn)成本遠(yuǎn)高于全血。基因重組血紅蛋白（rHb)血紅蛋白的化學(xué)修飾通過(guò)酵母、昆蟲(chóng)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、植物進(jìn)行重組血紅蛋白的表達(dá)。具有人為控制血紅蛋白產(chǎn)量及從根本上消除病毒污染的有點(diǎn)。基因策略：1）使紅細(xì)胞蛋白亞基間串聯(lián)；2）利用氫鍵、疏水作用力等穩(wěn)定四聚體；3）將特定氨基酸突變?yōu)榘腚?/p>

18、氨酸使形成鏈間二硫鍵。存在問(wèn)題：表達(dá)量低。關(guān)鍵環(huán)節(jié)：構(gòu)建表達(dá)的rHb工程菌；提高分離純化技術(shù)。血液代用品發(fā)展現(xiàn)狀（一）產(chǎn)品名稱生產(chǎn)商采用技術(shù)研究進(jìn)展PHP共軛物美國(guó)Apex Bioscience公司吡哆醛修飾聚氧乙烯共扼人血紅蛋白I期臨床HemAssist美國(guó)BAXTER公司雙阿司匹林交聯(lián)人血紅蛋白III期臨床Opero美國(guó)SOMATOGEN公司基因工程交聯(lián)人血紅蛋白III期臨床PEG-Hb美國(guó)ENZON公司PEG表面修飾牛血紅蛋白II期臨床Polyheme美國(guó)Northfield Lab公司戊二醛聚合人血紅蛋白III期臨床Hemopure美國(guó)Biopure公司戊二醛聚合牛血紅蛋白已在南非上市；在美國(guó)已批準(zhǔn)用于動(dòng)物治療；III期臨床結(jié)束，已申報(bào)生產(chǎn)許可Hemolink加拿大HEMOSOL公司棉籽糖聚合人血紅蛋白III期臨床Neo red ce