1、基因工程原理Principle of Gene Engineering 第一章第一節基因工程原理第二章 第二章 DNA重組第一部分 DNA的組成和構造1.1 DNA的組成1.2 DNA的空間構造線形DNA：環形DNA：1.3 DNA復制半保管復制方式復制起始位點replication origin sitebiobar.hbhcgz/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=20877 原核生物DNA的復制 解旋酶單鏈結合蛋白DNA拓撲異構酶引物酶DNA聚合酶DNA銜接酶biobar.hbhcgz/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=2

2、0876 真核生物DNA的復制 復制子從復制起始點開場復制出的一個DNA分子或一個DNA片段的核苷酸序列。復制子的數量原核生物的染色體DNA：單個真核生物染色體DNA：多個質粒DNA：單個、多個1.4 DNA轉錄啟動子和轉錄區的構造啟動子：Promotor，DNA分子上能與RNA聚合酶結合并構成轉錄起始復合體的區域，在許多情況下，還包括促進這一過程的調理蛋白的結合位點。 Pribnow box5-AGGAGG-3SD序列Shine-Dalgarno sequence; SD sequence 1974年，由J.Shine和L.Dalgarno發現SD序列：在細菌mRNA起始密碼子AUG上游10

3、個堿基左右處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與細菌16SrRNA3端識別，協助從起始AUG處開場翻譯。Pribnow box5-AGGAGG-3SD序列1.5 DNA轉錄終止子transcription terminator終止子Terminator是一段位于基因或支配組末端的DNA片段，可中斷轉錄作用。原核生物擁有兩種類型的終止子，包括：本體轉錄終止子Intrinsic transcription terminators：-依賴轉錄終止子Rho-dependent transcription terminators：不依賴于蛋白質輔因子就能實現終止作用。依賴蛋白輔因子才干實現終止作用。這種蛋白

4、質輔因子稱為釋放因子，通常又稱因子，與RNA螺旋酶蛋白復合物。兩類終止子有共同的序列特征：在轉錄終止點前有一段回文序列。富含GC回文序列：雙鏈DNA中含有的兩個構造一樣、方向相反的序列稱為反向反復序列，當該序列的雙鏈被翻開后，可構成部分“十字形構造。這段序列被稱為回文序列。1.6天然DNA的來源和用途染色體DNA：分別目的基因的主要資料，1000106kb病毒DNA：用于構建基因克隆載體,T4、質粒DNA：用于構建基因克隆載體線粒體DNA：呼吸作用的基因葉綠體DNA：光協作用的基因存在與生物體內的DNA1大腸桿菌源質粒DNA的提取2噬菌體DNA的提取3氯化銫法制備植物基因組DNA1.7 天然D

5、NA的的提取 適宜的生物資料裂解細胞分別DNA純化核檢測1大腸桿菌源質粒DNA的提取松弛型質粒：加氯霉素嚴緊型質粒：不加氯霉素2噬菌體DNA的提取1.8 DNA的純化氯化銫-溴化乙錠延續梯度離心法離子交換層析法瓊脂糖凝膠電泳洗脫法“基因純試劑純化從DNA樣品中去掉EB2.2.4 DNA濃縮2.2.5 DNA純度檢測第三次課終了！第二部分 基因工程工具酶基因工程工具酶限制性核酸內切酶DNA銜接酶和激酶DNA聚合酶和RNA聚合酶DNA和RNA修飾酶。一、序列特異的DNA限制性內切核酸酶 (Restriction endonuclease, RE 指可以識別雙鏈DNA分子中特殊核苷酸序列，并使每條鏈

6、的一個磷酸二酯鍵斷開的核酸內切酶。來源：原核生物種類：500多種作用：把外源DNA切割成片段。第一型Type I：能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解第二型Type II：只催化非甲基化的DNA的水解第三型Type III同時具有修飾及認知切割的作用限制性內切酶的命名和書寫：Hind III細菌屬名細菌種名菌株酶編號Haemophilus influenzae dRE的功能:防御外源DNA感染,利于遺傳的穩定性RE抑制了細菌種屬間的交叉繁衍,但甲基化酶的某些誤差,又使得不同菌株間DNA的重組成為能夠,利于生物的進化.1968年,從大腸桿菌中分別到了I型RE,1970年,從大腸

7、桿菌中分別到了II型RERE的發現：3.1.1限制性核酸內切酶作用機制OH3P-55P3HO1在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位,切割DNA分子,構成鏈的斷裂.識別序列:又叫靶子序列,是由4-8個核苷酸組成的特定核苷酸序列. 3.1.2限制性核酸內切酶的識別序列旋轉對稱或二重互補對稱延續的:例如：5A B C C B A33A B C C B A5延續的:5A B N B A33 A B N B A5EcoR IBamH IGAATTCCTTAAGGGATCCCCTAGG2識別序列在DNA分子上出現的頻率例如：識別序列核苷酸個數出現識別序列的幾率41/44 （1/256）61/46 (1/4

8、096)DNA長49000bp，Bgl II的識別序列為AGATCT所以實際上在DNA中， Bgl II識別序列應該出現： 49000/4096=12次。 實踐上，僅出現6次。同裂酶(isoschizomer)-來源不同,但識別同樣的核苷酸靶子序列. 例如:Hpa II和Msp I的識別序列都為5.CC GG.33.GG CC.5 BamH I：5 GGATCC 3Bcl I： 5 TGATCA 3Bgl II ： 5 AGATCT 3 同尾酶(isocaudamer)-來源不同,識別的核苷酸靶子序列不同,但產生一樣的粘性末端. 例如:Bam HI, Bcl I, Bgl II是一組同尾酶切割

9、后的末端是GATC.3.1.3 限制性核酸內切酶切割DNA的位點多數在識別序列內部。環形DNA切割后的片段數：N 線形DNA切割后的片段數：N+1DNA片段末端種類：粘性末端：磷酸二酯鍵斷裂位置是交錯的平末端：斷裂位置在對稱軸切割位點表示方法5-CTGCAG-33-GACGTC-5Pst I可以表示為：5-CTGCA G-3反響總體積：20微升酶的用量緩沖液的組成與酶的種類有關反響時間1-3小時。3.1.4限制性核酸內切酶反響系統例： Bgl 對DNA的消化13 mL蒸餾水 2 mL 10 x緩沖液4 mL 底物DNA1 mL RE37，1-3小時依次參與：混勻離心升溫，使酶失活6510-15

10、min 除去酶蛋白限制性酶切反響普通流程底物DNA：DNA純度DNA分子構型識別位點側面序列位點偏愛DNA甲基化酶的用量酶的活性底物DNA：位點數量規范緩沖液的組成：緩沖液系統MgCl2或醋酸鎂NaCl或KClTris-HCl-巰基乙醇或二硫蘇糖醇DTT反響溫度：大多數是37，少數或高或低Star活性：某些限制性核酸內切酶在特定條件下，可以在不是原來的識別序列處切割DNA。3.1.5 限制性核酸內切酶的Star活性4二、DNA銜接酶DNA銜接酶能催化雙鏈DNA片段緊靠在一同的3-OH和5-P基團末端之間構成磷酸二酯鍵，使兩末端銜接。假設是兩個或兩個以上不同雙鏈DNA片段末端銜接，那么產生重組D

11、NA分子。3.2 DNA銜接酶缺口nick55335533DNA銜接酶5533DNA銜接酶裂口gap5533nick2酶-AMP復合物中的AMP與DNA鏈上的5P結合，構成DNA-腺苷酸復合物，P活潑起來33OH對活潑的P作親核攻擊，結果構成磷酸二酯鍵。1DNA銜接酶與輔助因子ATP或NAD+反響,生成酶-腺苷酸復合物.3.2.1 DNA銜接酶的作用機理E.coli DNA 銜接酶 T4 DNA 銜接酶但效率較低3.2.2 目前常用的DNA銜接酶1條DNA鏈具有3-OH,另1條DNA鏈具有5-P,而且3-OH 與5-P是相鄰的.3-OH 與5-P位于與互補鏈上的互補堿基配對的兩個脫氧核苷酸的末

12、端.吸能反響: E.coli DNA 銜接酶需求NAD+，T4 DNA 銜接酶需求ATP.3.2.3 DNA銜接酶作用條件缺口nick55335533DNA銜接酶5533DNA銜接酶裂口gap5533反響溫度：37酶用量：平末端1-2unit 粘性末端0.1unitATP：10mol/L1mmol/Lbuffer：Tris-HCl，KCl，DTT，BSADNA銜接酶反響條件具互補粘性末端片段之間的銜接具平末端DNA片段之間的銜接DNA片段末端修飾后進展銜接3.2.4 DNA片段之間的銜接方式具互補粘性末端片段之間的銜接具平末端DNA片段之間的銜接DNA片段末端修飾后進展銜接DNA片段末端同聚物

13、加尾后進展銜接粘性末端修飾成平末端后銜接DNA片段5段磷酸化作用后銜接DNA片段末端同聚物加尾后進展銜接粘性末端修飾成平末端后銜接DNA片段5端脫磷酸化作用后銜接5 催化以DNA單鏈為模板，以4種脫氧核糖核苷酸為底物，合成一條與模板序列互補的DNA新鏈的酶。三、DNA聚合酶DNA聚合酶包括：大腸桿菌DNA聚合酶I大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶T4 DNA聚合酶T7 DNA聚合酶修飾的T4 DNA聚合酶逆轉錄酶耐熱性DNA聚合酶一耐熱性DNA聚合酶1956年，美國Kornberg從大腸桿菌中分別出來。由大腸桿菌基因polA編碼，單鏈多肽蛋白質。分子量：109 kD球形，65埃二大腸

14、桿菌DNA聚合酶IE.coli DNA pol I1. DNA聚合酶I反響需求的條件:全部4種脫氧核苷三磷酸,和Mg+. dATP dCTP dTTP dGTP帶有3-OH游離基團的引物鏈. 2. DNA聚合酶I催化的反響(1)聚合反響:53方向DNA聚合酶I催化的聚合反響是在引物鏈3-OH與dNTP分子的-P-基團間.dNTP接上后,又提供了1個3-OH末端,繼續銜接dNTP分子.合成方向是5 3DNA聚合酶I的聚合反響機理引物模板PPi(2) 5 3核酸外切酶活性:pol Ipol I(3) 3 5核酸外切酶活性:polI3、DNA聚合酶I在基因工程中的運用DNA缺口轉移nick tran

15、slation反響用于分子克隆。制備高比活的DNA探針。DNA聚合酶I的5-3核酸外切酶活性3355nick3-OH 5-P缺口雙鏈DNA聚合酶I 的聚合活性3355nick3-OH 5-P切去1個5核苷酸在3-OH上加上新的核苷酸3355nick3-OH 5-P32P標志的核苷酸DNA缺口轉移線狀分子DNaseI切斷DNA鏈DNA聚合酶I 5-3核酸外切酶活性DNA聚合酶I 的聚合活性構成1條具有32P標志的合成DNA鏈標志探針在5端切去1個核苷酸切出1個缺口在3-OH加上1個32P標志的核苷酸32P標志的核苷酸制備高比活的DNA探針25l1 g純化的目的基因DNA片段；適量的DNaseI；

16、DNA聚合酶；32P-dNTPs；dNTPs；典型的反響體系：二大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段與DNA末端標志Klenow聚合酶的特點：分子量：76103dal具有聚合酶的活性具有3-5的核酸外切酶的活性。DNA聚合酶IMW：34103 dal： 53核酸外切酶活性。MW：76103 dal：Klenow片段酶，保管DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性?？莶輻U菌蛋白酶Klenow聚合酶的運用：cDNA克隆中第二鏈合成的催化補平雙鏈DNA的3凹端。標志DNA片段的末端：帶標志的dNTPDNA序列測定：Sanger末端終止法cDNA的合成第二鏈DNA的合成加SalI銜接物加EcoRI銜接

17、物與pUC重組cDNA克隆中第二鏈合成的催化5GATCT 33 A 55GATCT 33 32P-GA 55GATCT 3332P-AGA 5具有3隱蔽末端的DNA片段Klenow酶， 32P-GTP 參與的種類根據5末端決議Klenow酶， 32P-GTP， 32P-ATP補平雙鏈DNA的3凹端。標志DNA片段的末端：帶標志的dNTPDNA序列測定：Sanger末端終止法CGTACCTCGTTCATGACAAGCGTCTCAddGAGTddCGCAGAGTddTGTTCGCAGAGTddACTGTTCGCAGAGT*Klenow片段三T4 DNA聚合酶從T4噬菌體中分別的噬菌體基因43編碼具

18、有53聚合酶活性具有35核酸外切酶活性，是Klenow片段的200倍左右。取代反響。取代反響特點：當反響混合物中沒有dNTP時，T4DNA聚合酶只需3-5核酸外切酶活性，從3-OH端降解DNA。當反響混合物中僅有1種dNTP時，3端降解在暴顯露互補的核苷酸時停頓。32P標志的核苷酸5533A T C G T A C A GT A G C A T G T C5533A T C G T A C C A T G T C5533A T C G T A C A GT A G C A T G T GT4 DNA聚合酶，dGTP具有3-OH末端的DNA片段參與32P dNTPs32P標志的核苷酸逐漸取代了外切酶刪掉的原有核苷酸取代反響。四反轉錄酶把RNA轉錄成DNA的酶。又叫依賴RNA的DNA聚合酶，或RNA指點的DNA聚合酶。1970年發現，在多種腫瘤病毒中發現，常見的AMV鳥類骨髓母細胞瘤病毒的反轉錄酶。包括： 鏈：65 103dal 鏈：95 103dalDNAmRNAprotein轉錄翻譯反轉錄自我復制酶活性：RNA指點的DNA聚合酶活性DNA指點的DNA聚合酶活性RNase H活性： RNase H是一種專門切割DNA與RNA雜交鏈上RNA分子的酶RNA模板DNA引物AMVDNARNAAMVAMV 催化以DNA和RNA為模板，以4種三磷酸核苷ATP、UTP、CTP、