1、第四章 體內藥物分析 方法的建立與驗證1第一節 分析方法的設計依據 在建立分析方法之前，應充分利用現代科技成就和前人的研究成果，系統檢索國內外的科技文獻，對藥物在生物體內的存在狀況、藥代動力學參數、分析檢測方法等相關資料加以分析和研究，以供借鑒。對于尚無文獻報道的藥物，亦可參考同類藥物的相關文獻。 檢索文獻，可在最短時間、最小的花費（磨刀不誤砍柴工）建立一個好的分析方法！這是試驗前要做的第一件事！大四的同學們，你們查過文獻嗎？2血藥濃度 94-2008 5122篇3451992年創刊的中國臨床藥學雜志 2001年第二軍醫大學長海醫院主辦的藥學服務與研究兩刊于2004年同時成為中國科技核心期刊

2、臨床藥學專業性的學術期刊有：6不想當將軍的士兵不是好士兵 容量大的U盤：中國臨床藥學雜志、藥學服務與研究中大量的相關文獻拷貝下來 另外以 “臨床藥學”、“臨床藥師”、“合理用藥”、“藥學監護”、“血藥濃度”等為關鍵詞，查找相關的文獻，copy !看文獻 寫論文 提職稱7這門課有兩個實驗，要求大家以論文的形式寫實驗報告！實驗一 改進的柱前衍生-HPLC法測定丙戊酸鈉的血藥濃度 由老師提供文獻。看完文獻后，考慮一個問題：該如何設計、優化實驗條件？實驗二 姜黃素-PVP固體分散體在兔體內的藥代動力學參數的測定 大家到圖書館電子閱覽室查閱文獻！ 關鍵詞：姜黃素，血藥濃度 或：姜黃素 ，（藥代）動力學

3、要看PDF 文檔，電腦要安裝 ADOBE READER軟件 8一、待測藥物的理化性質及體內存在狀況 準確測定生物樣品中的藥物或其特定代謝物通過一定的生物樣品預處理使待測物從結合物或綴合物中釋放出來。故此，應首先考慮樣品預處理方法待測藥物的理化性質藥物在生物體內的存在狀況藥物在生物體內的生物轉化(代謝)途徑建立分析檢測方法的主要依據有：9(一)待測藥物的理化性質 藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數等決定預處理方法及萃取方法具有親脂性在適當的pH值下用溶劑萃取具有強極性或親水性沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取等具有揮發性GC測定法具有光譜或電化學特性分析檢測方法藥物的穩定性萃取濃

4、縮技術對酸堿不穩定避免使用強酸或強堿性溶劑 對熱不穩定避免高溫蒸發溶劑-一個例子10另一個“兩彈一星”：拯救5億人的“中國神藥” -青蒿素 瘧疾是危害人類最大的疾病之一。全球每年瘧疾病人超過5億，死亡100萬人以上。屠呦呦：古醫書中有青蒿治療瘧疾的記錄。起初青蒿的有機溶劑提取物對瘧疾的抑制率很低，不甘愿，又翻出古醫書： “青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之。” 和中藥常用的煎熬法不同？原來里面用的是青蒿鮮汁！ 改用沸點較低的乙醚提取，抑制率達100% 溫度！11(二)待測藥物的體內存在狀態與血漿蛋白結合的強弱及結合率的高低決定分離萃取方法 指標：提取回收率蛋白結合較強（非極性強）不宜直接采用

5、溶劑萃取 ？有機溶劑沒選對？吲噠帕胺、偽麻黃堿！體內濃度高低、代謝過程及其代謝產物決定分析檢測技術濃度較低（尤其有代謝產物共存）代謝產物的干擾與特定代謝產物的同時測定采用HPLC或LC-MS等分析檢測技術 12二、分析測定的目的與要求 體內藥物分析的目的影響分析方法的應用藥代動力學研究藥物在體內吸收、分布、代謝和排泄過程血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代謝產物要求同時測定原形藥物和代謝產物 檢測寬線性范圍(CmaxCmax的1/20，4-5半衰期)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬性(分離能力)(原形藥物及其代謝產物的分離)方法不必強調方法的簡便、快速，按SOP，大多采用色譜及其脫線或

6、在線聯用技術，如HPLC、LC-MS建立分析檢測方法的主要依據有：13二、分析測定的目的與要求 臨床治療藥物監測 藥物濃度通常在有效治療濃度范圍附近方法盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品的測定，大多采用UV、RIA或EIA等。？中毒患者的臨床搶救 藥物濃度極高方法不必強調方法的靈敏度，強調方法的特異性和分析速度大多采用色譜及其聯用技術GC、GC-MS、RIA或EIA ？14三、生物樣品的類型與預處理方法生物樣品的類型與預處理方法決定分析方法的應用以血漿或血清為分析樣品采用蛋白沉淀、溶劑萃取預處理技術分析樣品較為“干凈”，可用HPLC檢測用RIA分析 ？FPIA法樣品的預處理方法可較為粗放經過

7、簡單的蛋白沉淀或不經任何預處理直接測定15四、實驗室條件 在設計體內藥物分析方法時，還應充分考慮到實驗室現有的或有可能在其它實驗室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。 此外，還應從方法的可行性、每個樣品測定耗時多少（10 min）、操作的難易及技術要求及儀器、設備要求、費用多少等等方面加以考慮。16 在阿齊霉素制劑生物等效性研究過程中，血樣中阿齊霉素的濃度范圍為5 ng/ ml1g/ ml ，其檢測方法可采用HPLC 法、LC-MS 法和微生物法等數種方法。若用HPLC 法來檢測該樣品，由于阿齊霉素的紫外吸收較弱，必須對樣品進行富集濃縮，則樣品的前處理方法采用液-液萃取法為佳；若用LC-M

8、S 法來檢測該樣品，則由于LC-MS 儀器的靈敏度足以檢測濃度為1ng/ml 以上的樣品，故樣品的前處理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法來檢測該樣品，則樣品連蛋白也不需沉淀，直接上樣即可。 例子 117 當然，用LC-MS 法來檢測阿齊霉素時，有些分析上作者采用了液-液萃取法，也有另一些分析工作者采用了固相萃取法來處理血樣，這些做法雖然行得通，但顯然它們不但增加了樣品處理的所需時間和工作量，而且增加了樣品處理的成本，因此阿齊霉素的血樣處理最好采用蛋白沉淀法。18 蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但從樣品的穩定性角度考慮，阿齊霉素遇酸不穩定，故只能采用甲醇沉

9、淀法或乙腈沉淀法，考慮到乙腈沉淀蛋白效果優于甲醇，且該方法阿齊霉素的回收率較高，故阿齊霉素血漿樣品的前處理方法以乙腈沉淀蛋白法為最佳。19 如果測定的是血清中頭孢拉定的濃度，頭孢拉定為-內酰胺類抗生素，對酸穩定，且酸有利于頭孢拉定的提取。蛋白沉淀法的選擇就要采用高氯酸沉淀法了。-具體問題具體分析 -信息，查文獻例子 220第二節 分析方法建立的一般步驟 一、分析方法的選擇二、分析方法的建立(一)檢測條件的篩選(二) 分離條件的篩選21一、分析方法的選擇體內藥物分析方法的設計受多種因素影響生物樣品中的藥物濃度決定分析方法的首要要因素生物樣品中藥物或其特定代謝產物的濃度低、樣品量少難以通過增加取樣

10、量提高方法靈敏度通過選擇適當的分析方法適應樣品分析需求。常用分析方法的檢測限度及分離能力見表4-122摘自:化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則 二五年三月 SFDA頒布（一）常用分析方法（1）色譜法：氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜質譜聯用法（LCMS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多數藥物的檢測；（2）免疫學方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等，多用于蛋白質多肽類物質檢測；（3）微生物學方法，可用于抗生素藥物的測定。 從目前發展看，生物樣品的分析一般首選色譜法，如HPLC、GC法或LCMS、GCMS法，這類方法靈敏度、特異

11、性、準確性一般都能適應臨床藥代動力學研究的需要，多數實驗室也具備條件，因此應用最廣，大約90%的藥物濃度測定可以用色譜法來完成。具體選用何種分析方法應根據藥物的化學結構、理化性質、儀器條件以及借鑒文獻方法多方面因素來考慮確定。23二、分析方法的建立初步擬定分析方法后進行一系列試驗工作，以選擇最佳分析條件同時驗證分析方法的可行性，以確認是否適用于實際生物樣品分析方法的建立步驟第一步：檢測條件的篩選第二步：分離條件的篩選24(一)檢測條件的篩選 標準物質 照擬定的分析方法(不包括生物基質的預處理)測定 確定最佳分析檢測條件(如色譜條件)和檢測靈敏度HPLC 調整檢測器(類型、條件) 、色譜柱(型號

12、、牌號、填料性狀與粒經、柱長度)、流動相(組分及其配比)及其流速、柱溫、進樣量、內標物質的濃度及其加入量等 使各物質具有足夠的方法靈敏度(LOQ ) 良好的色譜參數(n、R、T) 適當的保留時間(tR)25(二)分離條件的篩選在進行分離條件篩選時，應考察生物基質中的內源性物質及代謝產物對分離與檢測的干擾，步驟如下：1空白溶劑試驗 溶劑(方法特異性)2空白生物基質試驗 (方法特異性)3模擬生物樣品試驗 方法效能指標4實際生物樣品測試 代謝產物(方法特異性)261空白溶劑試驗待測藥物的非生物基質溶液（通常為水溶液）采用擬定的分析方法進行衍生化反應、萃取分離等 樣品預處理（反應試劑、衍生化試劑、萃取

13、溶劑等）測定響應信號（如HPLC峰面積或峰高）考察目標方法的特異性空白值應盡可能小，并能有效校正27對色譜分析法而言可通過改變反應條件、萃取方法或萃取條件（萃取溶劑的極性、混合溶劑的配比，固相萃取填料性質、沖洗劑與洗脫劑及其用量等），甚至檢測器類型空白試劑信號應不干擾藥物的測定（如R1.5） 本步驟主要考察需經化學反應的預處理過程，若預處理過程僅為生物樣品的提取分離，則可不進行該步驟，直接進行空白生物基質試驗 282. 空白生物基質試驗空白生物基質 (blank biological matrix)如空白血漿按 “空白溶劑試驗” 項下方法操作考察目標生物基質中內源性物質對測定的干擾（方法特異性

14、）在待測藥物(或特定的活性代謝物、內標物質等)的“信號窗” 內不應出現內源性物質信號29celecoxib塞來考昔303. 模擬生物樣品試驗 模擬生物樣品空白生物基質中加入待測藥物，照 “空白溶劑試驗” 項下方法操作考察目標：方法的線性范圍、精密度與準確度、靈敏度、藥物的萃取回收率等各項技術指標 同時進一步檢驗生物基質中內源性物質以及可能共同使用的其他藥物對測定的干擾程度，即方法特異性31對色譜分析法而言進一步考察待測藥物、內標物與內源性物質(或其它藥物)的分離情況如色譜峰的 tR、n 和 T 是否與水溶液的一致 色譜峰是否為單一成分（如何確定？） 標準曲線的截距是否顯著偏離零點等均可說明內源

15、性物質是否對待測藥物或內標物質構成干擾324. 實際生物樣品的測試 空白生物基質和模擬生物樣品試驗確定的分析方法及其條件不能完全確認是否適合于實際生物樣品的測定藥物在體內可能與內源性物質結合(如血漿蛋白結合物)或代謝生成數個代謝產物及其進一步的結合物(或綴合物)實際生物樣品確立分析方法后，尚需進行實際生物樣品的測試考察目標：代謝產物對藥物、內標物質的干擾情況進一步驗證方法的可行性 ？33空白血漿空白血漿+標準標準溶液志愿者實際樣品空白溶劑試驗 多余？34第三節 分析方法驗證的內容與要求 基于以下原因需要對建立的分析方法學進行驗證：1、生物樣品量少2、藥物或活性代謝產物濃度低3、內源性物質的干擾

16、4、生物的個體差異較大35（二）方法學確證建立可靠的和可重復的定量分析方法是進行臨床藥代動力學研究的關鍵之一。為了保證分析方法可靠，必須對方法進行充分確證，一般應進行以下幾方面的考察：1、特異性(Specificity)2、標準曲線和定量范圍（Calibration Curve）3、定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）4、精密度與準確度（Precision and Accuracy）5、樣品穩定性(Stability)6、提取回收率7、微生物學和免疫學方法確證8、方法學質控摘自:化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則 36 用于實際生物樣品分析之前： 需

17、要驗證 (validation) 分析方法的可行性與可靠性方法驗證時應考慮影響分析方法的所有可變因素： 取樣、樣品制備、色譜分離、檢測與數據評價 使用的樣品通常采用模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣 驗證的技術指標效能指標37驗證步驟首先為分析方法的驗證特異性、精密度與準確度、回收率、定量限與檢測限、穩定性等其次為生物基質中待測藥物穩定性的驗證室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循環 Freeze-and-thaw cycle38驗證的效能指標與基本要求1特異性（專屬性）避免干擾2標準曲線與線性范圍覆蓋所有濃度范圍3準確度與實際狀況相符4精密度結果可重現5定量限達到峰濃度的1/101/206穩定性確

18、保所有樣品準確測定7提取回收率確保檢測的靈敏度39一、方法特異性(專屬性或選擇性) 方法的特異性(specificity)又稱專屬性或專一性，通常與選擇性(selectivity)互用系指當有內源性物質存在時，方法準確測定待測物質的能力，通常表示所檢測的信號(響應)系屬于待測藥物所特有選擇性包括將待測物質與其代謝物及同服的其它藥物加以區分(分離)的能力特異性函蓋二者，以驗證所測定的物質與待測藥物的同一性 特異性用于考察方法的抗干擾程度。如果特異性不佳，方法的準確度、精密度、線性都將受到影響。因此確保特異性是建立和驗證一個分析方法的第一步。401. 內源性物質的干擾比較待測藥物或其活性代謝產物的

19、對照品 （或標準品） 空白生物基質 模擬生物樣品（空白生物基質中添加對照品）的檢測信號如HPLC色譜峰的 tR、n 和拖尾因子（T） 是否一致，以及與內源性物質色譜峰的分離度（R）確證內源性物質對分析方法有無干擾考察一個分析方法是否具有特異性，應著重考慮以下幾點：412. 代謝產物的干擾 比較模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號如HPLC中藥物色譜峰的 tR、n 和 T 是否一致，或改變色譜條件(色譜柱)再比較，以及與代謝產物的R，來確證代謝產物對分析方法有無干擾。結構已知的特定活性代謝物的測定通過HPLC-DAD和LC-MS確證色譜峰的單純性和同一性對于結構未知的代謝產物的測定采用L

20、C-LC-NMR進行結構的初步推測后，考察其干擾情況。42 對于色譜法至少要考察6個不同個體的空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對照物質色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖，以反映分析方法的特異性。對于以軟電離質譜為基礎的檢測法（LC-MS、LC-MS-MS）應注意考察分析過程中的介質效應，如離子抑制等。摘自:化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則 433. 伍用藥物的干擾TDM時 還要考慮患者可能同時服用藥物的干擾 通過比較待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生物樣品的檢測信號如HPLC色譜峰的 tR、n 和 T 是否一致來確證同時服用藥物對分析方法的干擾情況444. 與參比方法的相關性

21、 除上述方法外，有時還可使用參比方法對照法。參比方法一般選用特異性強、準確度高、線性關系良好的色譜法。如在TDM中使用UV(或RIA)時, 可以HPLC(或GC)為參比 參比方法測定結果為橫坐標(X); 擬定方法結果為縱坐標(Y)用最小二乘法計算回歸方程 YabX (坐標標度相等)、相關系數(r)表示兩種方法測得結果的一致性，若 r 1，表示擬定方法為非線性，如 RIA 中抗血清滴度選擇不當454. 與參比方法的相關性YabX 截距(a) 表示擬定方法受到恒定干擾的程度內源性物質(UV)斜率(b) 表示擬定方法受到比例干擾的程度標記抗原不純(RIA) 與參比方法的相關性比較，除顯示分析方法的特

22、異性外，還反映分析方法的準確度。斜率b表示兩種方法測得結果的一致性若參比方法準確度良好，且截距a0, 則擬定方法的準確度(回收率)為100b(%)46二、標準曲線與線性范圍標準曲線（standard curve） 校正（calibration curve） or 工作 （working curve）指生物樣品中所測定藥物濃度與響應（峰面積或峰高）的相關性（呈比例的程度）通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評價除少數方法（免疫分析法）外，標準曲線通常為線性模式常用的回歸分析法為最小二乘法（least squares）或加權最小二乘法（weighted least squares）線性范圍（line

23、ar rang）標準曲線的最高與最低濃度的區間在此線性范圍內，模擬生物樣品的測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度47二、標準曲線與線性范圍(續)標準曲線用模擬生物樣品建立線性范圍(不包括零點)應能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度建立標準曲線所使用的模擬生物樣品應使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質制備48標準曲線的一般建立過程： 標準系列溶液的制備內標溶液的制備 標準系列模擬生物樣品的制備、測定標準曲線的繪制加權最小二乘法限度要求49標準曲線的一般建立方法 1. 標準系列溶液的制備 標準物質對照品、標準品溶劑水或甲醇（或其他適當溶劑）濃度模擬生物樣

24、品中藥物濃度的50倍以上加入量為生物樣品總體積的2%以下避免標準模擬生物樣品與實際樣品存在較大差異。難溶性藥物，濃度較低應除去溶劑后再加入生物基質 結晶？否則,在實際樣品測定時應加入等體積的溶劑并渦旋混勻 50至少含58個濃度點(不包括零點，即空白)可覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式比例常數約為 2)若體內平均達峰濃度為50，其1/20為2.5設定最高濃度為100，最低濃度為1 (個體差異)512、內標溶液的制備內標物質對照品、標準品或化學試劑適宜的溶劑甲醇、水、乙腈或混合溶劑濃度與標準系列溶液的中間濃度相當如：某標準溶液5、10、20、4

25、0、80、160、320 g/ml，則內標的濃度應配制成40 g/ml 在這里，加內標溶液時并沒有象標準溶液那樣要求加入量為生物樣品總體積的2%以下，為什么？523. 標準系列模擬生物樣品的制備 空白生物基質(如血漿)加入標準系列溶液適量，渦旋混勻 標準模擬生物樣品的最高濃度應高于生物體用藥后的達峰濃度，最低濃度應低于Cmax的105。 目的涵蓋為防止在標準溶液加入及渦旋混合時造成的損失 ？先加入標準溶液 再加入空白生物基質渦旋混勻 534. 標準曲線的繪制以待測藥物的檢測響應(如色譜峰面積或峰高) 或與內標物質的檢測響應的比值(內標法)(因變量, y )對模擬血藥濃度 (自變量,x)求得回歸

26、方程( yabx )及其相關系數( )在一組由至少7個濃度(不包括零點)構成的標準曲線中，至多可有2個濃度點數據，可予剔除。但應有確切原因，如：（1）樣品處理有損失；（2）色譜圖有問題；（3）顯著偏離標準曲線其余應有至少5個濃度點在標準曲線上545. 加權最小二乘法 普通最小二乘法每個濃度點絕對誤差(yiyi)賦予同等的重要性 若標準曲線上的高低濃度相差懸殊(范圍達102)低濃度區的計算值相對誤差過大，難以滿足規定要求。加權最小二乘法回歸計算時增加一個權重因子(w)各濃度的響應值與回歸值的相對離差平方和達到最小 式中，wi為標準曲線上第i個濃度點的權重因子551）回歸方程(y = a + b

27、x)參數的計算現在有專業軟件562）權重因子的選擇選擇加權因子時兼顧考慮曲線上高、中、低各濃度點的準確度，賦予低濃度點以更大的權重在實際工作中的一般方法（1）當wi=1/(yi)2時，則（2）而yi與xi成正比（3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2 當高濃度點測量值的準確度下降過大低濃度點權重過大，降低低濃度點的權重，wi=k/xi57標準曲線的限度要求標準曲線至少包括5個濃度(通常為58個濃度,不包括零點)最高濃度應高于用藥后生物體內藥物的達峰濃度(Cmax)，最低濃度應為方法的LOQ(非LOD)，并應低于Cmax的105（1/10-1/20）若標準曲線濃度范圍較寬，可分為高低兩個

28、濃度區間(每個區間不少于5個濃度)，分別加權回歸如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200相關系數要求 0.99(色譜法)或0.98(生物學方法)回歸方程的截距應接近于零，b1使之具有較高的靈敏度-與坐標的標度選擇有關在藥代動力學或生物利用度研究中：58三、準確度 方法準確度(accuracy)系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度理論上應使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的。所以，通常使用模擬生物樣品測定，以測得的濃度與添加的理論濃度比較計算求得。一般用相對回收率(relative recovery，RR) 或 相對誤差(relativ

29、e error，RE)表示591. 測定法 取空白生物基質（如血漿）數份，照標準曲線項下方法操作，在標準曲線范圍內制備質控(quality control，QC)樣品高(接近上限)、中、低(接近LOQ) 3個濃度每一濃度至少5個樣本與隨行的標準曲線同法測定、計算，每個樣品分析測定1次 ，用標準曲線計算測得的濃度602. 結果計算與限度要求 計算測定值M(measured)的平均值與理論濃度(加入值)A(added)比值相對回收率相對誤差限度要求相對回收率應在85%115% (LOQ附近80%120%)RE在15% (LOQ附近為20%)61四、精密度 方法精密度(precision )系指每次

30、測定結果與多次測定的平均值的偏離程度表示該分析方法的可重復性(reproducibility)反映分析方法的可操作性，是方法驗證的基本要點之一理論上，精密度應使用實際生物樣品測定。但實際上生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.52ml)使用模擬生物樣品測定，且通常與方法準確度評價同時進行，如日內精密度即可使用方法準確度的測定數據計算。621. 表示方法方法精密度一般用標準偏差(standard deviation，SD)或相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)表示 SD=RSD= =在體內藥物分析中，方法精密度一般用RSD表示。63 批內(within-r

31、un或intra-assay)RSD 系指在同一分析批內測定結果之間的RSD。一個分析批通常在一個工作日內完成，又稱為日內(within-day)RSD。 無論是藥代動力學試驗或治療藥物監測監測，通常在一個工作日內難以完成全部樣品的分析。在不同工作日之間的實驗條件有可能發生微小變化，對分析結果有可能產生影響。所以，方法精密度除要考察批內RSD 外，同時還有考察批間RSD。 批間(between-run或inter-assay)RSD 系指在不同分析批的測定結果之間的RSD。因不同分析批通常是在不同的工作日內完成，又稱為日間(between-day，day-to-day)RSD。642. 測定法

32、分別測定法()取空白生物基質(如血漿)數份，照準確度項下方法，分別在同一批內和不同批間制備高、中、低 3個濃度的QC樣品，并分析測定批內RSD：一個工作日內完成，隨行制備一條標準曲線和每一濃度56個樣品，每個樣品測定1次，用隨行標準曲線分別計算3個濃度的RSD批間RSD：在至少5個工作日內完成，每一工作日內完成一個分析批的測定。每一分析批內制備一條標準曲線和每一濃度1個樣品，每個樣品測定1次；用隨行標準曲線計算3個濃度(每一濃度56個分析批數據)的RSD652. 測定法若實際樣品測定所用的分析批次少于5批，也可進行3個批次的連續分析(每1濃度的每1批次為56個樣本)采用多次分析的方差分析法 批

33、間RSD =批內RSD = =批內與批間RSD663. 限度要求在藥代動力學和生物利用度研究中對g/ml級水平的RSD一般應10%ng/ml級水平的RSD一般應15%在LOQ附近RSD應20%。 67五、定量限方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系指在保證具有一定可靠性(準確度與精密度符合要求)的前提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度，又稱為方法靈敏度(sensitivity)標準曲線上的最低濃度點(最低濃度點LOQ)要求應能滿足測定35個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度或Cmax的105準確度在80%120%(或RE在20%的范圍內)RSD20%68最低檢測限（

34、limit of detection LOD）：是指可在噪音水平下識別生物樣品中藥物的最低濃度，一般認為信噪比（S/N）3，信號可被檢測，故以S/N3時的樣品濃度作為LOD。 LOQ的檢測信號至少是LOD的2倍以上，以（S/N）10 作為 LOQ 的估計值。69LOD TestS/N370六、穩定性 生物樣品量較大時，在一個工作日內難以完成全部樣品的分析；有時樣品需進行復測。因此生物樣品及其預處理后的殘渣或溶液的穩定性就顯得尤為重要。需要對樣品的存放條件和時間進行考察，以保證分析結果的準確、可靠 方法穩定性 生物樣品的穩定性穩定性71（一）方法穩定性：首先考察待測藥物的標準品（內標、衍生化試劑

35、）或其分析溶液在實驗室溫度、濕度、光照及暴露空氣等條件下的穩定性； 在分析方法的建立時要考慮模擬生物樣品的預處理過程（提取、凈化及相轉移）及待測物（蒸干后的殘渣及其溶液）在室溫或冰箱中存放的穩定性。72短期穩定性： 主要考察模擬生物樣品在室溫、4或20以及凍融循環條件下的穩定性（二）生物樣品的穩定性長期穩定性：主要考察生物樣品長期冰凍（20 或80）后的穩定性，考察期限從生物樣品的采集到分析完畢的整個時間區間。73測定方法與要求1、取高、中、低三個濃度的QC樣品，在不同條件下存放不同時間后，每個樣品重復測定三次，平均值應為零時測定的5以內（經衍生化處理15以內）。若考察時間大于1天，則應與新制

36、QC樣品比較，若考察時間很長，可與在液氮中保存的樣品在相同條件下的測定值比較2、穩定性期限要求室溫下存放一般僅考察1個工作日（如1、2、4、8、24h）冰箱中數個工作日（或數星期、數月）74七、萃取回收率（Extaction recovvvery） 從生物樣品基質中回收得到分析物質的響應值與加入的標準品的響應值的百分比即為分析物的萃取回收率。也可以說是將供試生物樣品中分析物萃取出來供分析的比例。 應考察高、中、低 3 個濃度的萃取回收率，其結果應當精密和可重現751. 測定法取空白生物基質(如血漿)，制備高、中、低3個濃度的QC樣品(每一濃度至少5個樣品)，每個樣品分析測定1次另取等量的相同3

37、個濃度的標準溶液，用溶解模擬生物樣品經提取處理后的殘渣的溶劑稀釋至同體積，同法測定AT經萃取后的QC樣品的檢測信號或比值(內標法)AS未經萃取的標準溶液的檢測信號或比值(內標法)76實驗過程中的注意事項1、要考察是內源性物質還是提取方法對提取回收率產生影響2、測定回收率時，如采用內標法，內標應在提取之后，溶劑蒸發之前加入3、采用內標法定量時，應同時測定內標物質的提取回收率，只需配制一個中間濃度的QC樣品5份，同法測定。772. 限度要求在生物利用度或 TDM 時高、中、低濃度樣品的萃取回收率一般應70%高、中濃度的RSD應15%低濃度的RSD應20%內標法中內標物質的提取回收率應50%（RSD

38、 15%) 78（1）方法準確度(或相對回收率，relative recovery) （2）萃取回收率(絕對回收率，absolute recovery) 萃取回收率與相對回收率的比較：（1）萃取回收率主要考察生物樣品預處理過程造成的藥物的程度損失（2）相對回收率主要用來考察測定方法的準確度，采用標準曲線可準確計算生物樣品中藥物濃度79有時，低濃度的回收率大大低于高濃度的回收率，其原因可能是疏水性藥物易被玻璃器皿或聚乙烯管表面吸附。 解決辦法：表面硅烷化處理或加入可降低吸附的試劑如異丙醇、異戊醇、乙二胺等。80八、質量控制1、質控樣品（Quality control QC）：是指將已知量的待測藥

39、物加入到空白生物基質中配制的模擬生物樣品，用于整個分析過程中的質量控制，一般配制高、中、低三個濃度的樣品 分析方法建立并通過驗證后，方可進行實際生物樣品的測定，此時仍需對分析數據的質量進行監控！ 質控樣品池由不負責生物樣品測試的人員（推薦由獨立的人員）在實驗開始時制備，并與實際生物樣品在相同條件下儲存812、質量控制（1）測定法：在測定過程中，每批生物樣品都應建立相應的標準曲線，并隨行間隔以高低或低高測定高、中、低至少3個濃度的6個QC樣品（2）限度要求：6個QC樣品中至少4個的測定結果的準確度在各自正常濃度80120，RSD 20%，允許有2個QC樣品超出各自的2082 由于生物基質中存在內

40、源性的該物質，難以測定方法的LOQ和準確度，此時可通過以下方法制備空白生物基質：1、對生物基質進行處理-活性炭濾過、透析2、使用不含內源性物質的生物基質周期性變化的內源性物質如某些激素。3、使用替代基質如兔血漿、人血清蛋白、緩沖液九、生物樣品測定中其它情況（一）作為外源性藥物使用的內源性物質的測定83出現以下情況時，分析方法需進行再評價或交互驗證：1、改變色譜條件或生物樣品的處理方法樣品的前處理方法改變后需要對效能指標進行重新考察2、改變生物基質 不同物種的同種生物基質（大鼠血漿 人血漿）、同一物種的不同生物基質（血漿 血清）、甚至使用相同基質而使用不同抗凝劑等。（二）方法的再評價或交互驗證：

41、84（三）實際濃度超出標準曲線的處理：1、濃度高于定量上限取樣品用空白基質稀釋，同時制備高于定量上限的QC樣品，同法稀釋后測定，以確認稀釋的有效性。2、濃度低于LOQ增加生物樣品的體積，使測定液的濃度高于LOQ。應在相同條件下制備QC樣品和增加體積后的空白生物基質進行試驗，以確認方法的準確度、精密度和特異性符合要求。85第四節 體內藥物分析方法應用示例第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥鹽酸環丙沙星片人體生物等效性研究一、文獻調研在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中極微溶解，在氯仿中幾乎不溶，在氫氧化鈉試液中易溶；環丙沙星游離體在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中極微溶解，在稀醋酸中溶解。 86藥動學參數吸收過程

42、空腹口服后吸收迅速、人體生物利用度約為49%70%Cmax 口服500mg后平均Cmax為2.42.6mg/LTmax 12hT1/2 血中T1/2約為4h，腎功能減退時稍有延長至6h蛋白結合率20%40%代謝口服給藥24h內，40%50%原形、15%代謝物經腎排出87體內分析方法RP-HPLC色譜柱ODS色譜柱流動相甲醇(乙腈)-磷酸(枸櫞酸)緩沖液(三乙胺調節pH2.33.5)，或離子對色譜: 溴化十六烷基三甲基銨(氫氧化四丁基銨)檢測紫外或熒光檢測生物樣品預處理蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進樣溶劑萃取法二氯甲烷-異丙醇、氯仿-異丙醇混合溶劑蛋白沉淀-溶劑萃取乙腈沉淀蛋白后二

43、氯甲烷-異丙醇提取 88二、分析方法設計1分析方法血漿蛋白結合率低(20%40%)、以原形從腎排泄生物等效性研究測定血漿中環丙沙星原形藥物的濃度-時間曲線。初步擬定：采用RP-HPLC法2檢測方法紫外靈敏度1ng，若取血漿0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l進樣，則要求血漿中環丙沙星濃度在50ng/ml以上，當Cmax在2g/ml以上(口服500mg)時基本可滿足生物等效性研究要求熒光靈敏度0.1ng，能滿足本試驗要求 893樣品制備方法初步擬定采用簡便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接進樣分析預試含75%乙腈的提取液100l進樣后，色譜峰理論板數、對稱性下降(前沿峰)，進而導

44、致檢測靈敏度降低(峰高降低)經進一步試驗，確定為：血漿0.5ml乙腈1ml沉淀蛋白二氯甲烷-異丙醇(95:5)5ml萃取60氮氣流吹干流動相200l溶解20l進樣靈敏度可達2ng/ml(血漿濃度)，符合要求(Cmax2g/ml) 90三、實驗方案1給藥方案 20名受試者隨機分為兩組，每組10人第1次試驗第一組口服受試制劑(相當于環丙沙星500mg)，第二組口服相同劑量的參比制劑第2次試驗第1次服藥后第7天（有足夠長的清洗期）開始，兩組交換給藥912血樣的采集與處理分別口服給藥前和給藥后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(57

45、個t1/2)小時由肘正中靜脈取血 4 ml立即移入經肝素處理的離心試管中，靜置5分鐘后，離心15分鐘(3000rpm)，分離血漿，-20冰箱中保存待測923血樣分析法色譜條件高效液相色譜儀(包括LC-10ATvp泵，RF-530熒光檢測器)；色譜柱為Kromasil ODS-AP(200mm4.6 mm，5m)流動相為乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min激發波長為ex=277nm，發射em=445nm柱溫為40。 933血樣分析法血漿樣品的預處理取血漿0.5ml，加內標溶液(10g/ml諾氟沙星甲醇溶液）50 l、乙腈1.0ml，渦旋混合30s，離心5min

46、，取上清液1ml，加二氯甲烷-異丙醇(95:5)混合溶劑5ml，渦旋振蕩1min，離心5min，棄去上層水相，吸取下層有機相，60下氮氣流吹干，殘渣加流動相200l，渦旋溶解30s，離心5min，取上清液20l進樣 94四、分析方法驗證1方法特異性環丙沙星峰tR=12.4min，諾氟沙星(內標物質)tR=10.9min，各峰均獲得完全分離，內源性物質峰(與空白血漿樣品一致)tR=8.6min對測定無干擾。志愿者用藥后的血漿樣品色譜圖中環丙沙星與內標物質峰與模擬血漿樣品中環丙沙星與內標物質峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故不認為代謝物有干擾952標準曲線標準系列溶液取鹽酸環丙沙星，加水制成

47、1、2、5、10、20和50g/ml的標準系列溶液，冰箱保存標準系列模擬血漿樣品取空白血漿0.5ml，加環丙沙星標準系列溶液各50l，配制成相當于濃度為0.1，0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 g/ml的QC樣品，冰凍(-20)測定法取QC樣品，照“血漿樣品的預處理”項下方法操作，以環丙沙星濃度C為橫坐標，環丙沙星與內標物質的峰面積比值Y為縱坐標，用加權最小二乘法經Excel運算，求得的直線回歸方程為：Y=1.33C-0.02583，R2=0.9951(C=0.15.0 g/ml)963方法精密度與準確度QC樣品濃度為 0.1、0.5 和 2.0 g/ml分析批次3批，每批 5 樣品測得

48、濃度0.0988、0.4537 和 2.128 g/ml準確度RE(%)-1.2%、-9.3% 和 6.4%精密度批內(%)6.7%、4.6% 和 3.9%批間(%)8.9%、9.6% 和 12.3%974方法定量限受試制劑和參比制劑的Cmax分別為3.2020.496和3.3000.730 g/ml方法的LOQ為0.1 g/ml 0.16 g/ml (Cmax的1/20)準確度和精密度均符合要求：RE為-1.2% 日內RSD為 6.7% 日間RSD為 8.9%98表4-2 血漿中環丙沙星HPLC測定法的準確度與精密度考察結果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8

49、457.12179.6 95.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.22 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1105.9487.82251.3 95.8456.82252.2 86.3456.82240.93 97.6450.71911.6103.8446.91993.0 99.5436.62115.7105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD 6.8 19.7 118.7RE（%）-1.2 -9.3 6.4批內RSD（%） 6.7 4.6 3.9批間RSD（%） 8.9 9.6 12.3表4-2 血漿中環丙沙星HPLC測定法的準確度與精密度考察結果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179