1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。DNA計算中的熒光技術應用及發展-DNA計算中熒光技術的應用及其發展張成楊靜王淑棟(北京大學信息科學技術學院，高可信度軟件技術教育部重點實驗室，北京100871)摘要：DNA計算作為前沿科學研究的重點和熱點，已經從簡單發展為復雜，從理論轉化為應用。在這一過程中，反應速度快，變化靈敏的熒光標記技術發揮了重要的作用。本文圍繞DNA計算和熒光標記技術兩個方面進行說明。一方面，對近年來DNA計算中熒光技術的應用進行了總結：（1）熒光標記的表面計算。（2）與某些酶切技術相結合的熒光檢測。（3）與DNA鏈置換相結合

2、的熒光技術。（4）與基因沉默技術相結合的熒光DNA邏輯門。（5）與DNA自組裝立體結構相結合的熒光技術。（6）與DNA變構相結合的熒光技術。另一方面，介紹了幾種近年來發展起來的新型熒光技術：（1）熒光信號識別放大技術。（2）與磁珠技術相結合的熒光技術。（3）與PH值變化相結合的DNA熒光技術。（4）與miRNAs檢測相結合的熒光技術。在今后的研究中，只有將這兩者緊密結合，才能發揮DNA計算天然的優勢。關鍵詞：DNA計算；熒光標記技術；納米技術；DNA分子；雜交1引言DNA由于其具有的特性，在大自然的進化中，被選擇為穩定的遺傳物質。在細胞中，DNA精細地編碼并控制著整個細胞的新陳代謝。另一方面，

3、DNA分子容易構成二級甚至三級結構。因此，DNA作為計算工具有著得天獨厚的優勢1,2。近年來，DNA計算領域發展迅速，尤其在DNA分子自組裝、DNA納米裝置等方面3。然而伴隨著DNA計算解決問題的規模增大和形式多樣化，求解過程中DNA分子數量急劇增加以及DNA分子結構復雜性的加大，求解過程中實驗過程繁瑣且存在誤差，使得DNA計算中解的標記和檢測變得更加困難4。為了解決這一難題，熒光技術在DNA計算中逐漸得到了廣泛的應用。熒光是指某些物質受到某種波長的光激發后，其原子中的電子被激發到較高能級，產生的發射光。熒光物質分子都具有剛性結構和共平面的-共軛體系。在激發態時，這種結構具有穩定性，可以持續數

4、秒鐘，從而有利于能量的轉移5。DNA熒光技術在生物學領域中已經有很多應用，如近年來發展起來的DNA熒光標記、real-time檢測技術、分子信標技術等。熒光標記DNA簡單便捷，可以實時檢測，而且靈敏度非常高，這些特點都使得其在DNA計算中具有廣泛的應用前景。目前，結合熒光技術的DNA計算已經成為前沿研究熱點。熒光技術在DNA計算中的應用主要有如下幾類：（1）熒光標記的表面計算：通過DNA固定化和雜交技術，在固相表面通過熒光標記進行計算。（2）與某些酶切技術相結合的熒光檢測：利用特定酶與DNA分子的特性，通過檢測酶切后熒光量進行計算。（3）與DNA鏈置換相結合的熒光技術：巧妙利用DNA分子的三鏈

5、甚至多鏈結構，通過加入引發鏈，來釋放另一DNA鏈。（4）與基因沉默技術相結合的熒光DNA邏輯門：利用RNAi技術控制表達熒光蛋白，從而構建了多重邏輯門。（5）與DNA自組裝立體結構相結合的熒光技術：在DNA自組裝結構的基礎上，結合了熒光標記技術。（6）與DNA變構相結合的熒光技術：通過DNA分子的不同狀態，構建了可控的熒光納米裝置。近年來，熒光技術不僅應用于生物學本身，而且在DNA計算、信息學等諸多領域具有很大的應用潛力。下面有幾種近年來發展起來的新型熒光技術：（1）熒光信號識別放大技術。（2）與磁珠技術相結合的熒光技術。（3）與PH值變化相結合的DNA熒光技術。（4）與miRNAs檢測相結合

6、的熒光技術。相信隨著DNA計算和熒光技術的發展，這兩者必將緊密結合，使得DNA計算的種類和方法更加多樣和成熟。2DNA計算中熒光技術的應用2.1熒光標記的表面計算DNA表面計算其基本原理是：通過DNA固定化和雜交技術，將代表所有可能存在解的不同DNA序列固定在固相表面，然后通過多次的雜交以及降解過程來篩選正解。通過熒光標記可以檢測每次和最終計算的結果。2002年，Adleman組使用雜交池完成了一個20個變量的3可滿足性問題6。2004年XingPingSu等在2000年Liu7的工作基礎上，設計了一種通用型的DNA表面計算模型8。同年，KristianeA.Schmidt等利用單分子雜交熒光

7、標記技術4個變量的可滿足性問題9。下面以2000年，Liu等發表在nature上的DNA表面計算經典實驗為例，說明其解決SAT問題的過程7。由于該問題共有16種可能性，故將代表著不同可能解的DNA片段固定在固相表面。在每一次的雜交篩選過程中，加入與固定DNA鏈特異性互補的DNA。那末，被雜交的固定DNA鏈變為雙鏈，而未互補的單鏈DNA則被核酸外切酶降解。通過數次操作，存在于固相表面的DNA鏈就是每次經雜交而保留下來的DNA鏈，也就是代表正解的DNA鏈。該實驗中，熒光技術主要應用在解檢測的過程中：使用一條生物素標記的引物和另一條熒光標記的引物，以固相表面所有可能解的DNA片段為模版，進行PCR。

8、利用磁珠將PCR雙鏈產物吸附，再分離雙鏈，分離出熒光標記的ssDNA。將這些ssDNA與經過多次雜交篩選的固相雜交，只有哪些存留在固相表面的DNA鏈可以雜交上，于是特定的位置就可以檢測到較高熒光強度。圖1-1實驗示意圖圖1-2列陣熒光檢測結果2.2與某些酶切技術相結合的熒光檢測利用酶與DNA分子的特性，通過檢測酶切后熒光量進行計算。其實就是利用某些酶與DNA分子空間結構的相互作用，再結合熒光技術來共同實現的。這種方法具有靈敏度高，反應速度快等特點。其最大的優點就是巧妙地將酶的生物特性與計算問題相結合，極大地豐富了DNA計算的手段。2001年，Wang等在上述表面計算實驗的基礎上對解的檢測又進行

9、了新的改進，即將酶切和熒光技術相結合10。通過上述核酸外切酶的方法，利用新技術完成單鏈DNA的解的檢測。其基本思想如下：左側DNA探針的3端至少和右側雜交的DNA探針有一個堿基的重合，并使得右側探針有5端呈單鏈狀態。此時右側探針由兩部分組成：一部分是和目標序列形成雙鏈的；另一部分則是由非互補的5端DNA鏈組成（見圖2A）。此時該非互補的5端DNA臂會覆蓋在上游寡核苷酸鏈上，與左側探針至少有一個重合的堿基。恰恰在這重合的位置，可以形成酶切位點。因此，非互補的5端DNA臂可以被切割而釋放。利用這一原理，結合熒光技術，如圖所示，將熒光基標記在非互補DNA鏈的5端，而將熒光淬滅基標記在重合的酶切位點3

10、端方向（見圖2B）。這樣，只要酶切位點被酶切，標記有熒光基的非互補的5端DNA鏈就會被釋放，從而與熒光淬滅基分離，使得熒光釋放量大大提高。這種方法可以有效檢測目的片斷是否存在。文中還將PCR方法檢測目的片斷與這種熒光檢測法進行了對比，發現該方法比PCR檢測具有更高的靈敏度。圖2實驗原理示意圖圖3幾種邏輯門的構成示意圖MilanN.等2003年研制了一種名為MAYA的游戲。這是一種利用特殊的DNA酶E6（一種依賴于DNA的RNA酶）構建起來的邏輯門11。這種酶識別的DNA底物要求具有特殊結構（如3a圖所示）。只有當上部寡核苷酸探針與E6的支架區互補，上部寡核苷酸才能被切斷釋放。將寡核苷酸兩端分別

11、標記熒光淬滅基（如羅丹明）和熒光基，那末只有寡核苷酸探針被切斷釋放，熒光基才能有效激活并釋放熒光。這是MAYA游戲進行邏輯判斷的主要檢測手段。構建有效的空間位阻是實現這個檢測手段的關鍵。當寡核苷酸探針的結合使綠色標記的位阻消失的時候，加速酶切反應；當寡核苷酸探針的結合使紅色標記的位阻消失的時候，降低酶切反應。基于以上原理，構建出以下幾種邏輯門：YES型、NOT型、AND型和AND-AND-NOT型。YES型邏輯門（圖3b所示），當i1寡核苷酸加入時，消除原來i1環狀結構，從而標記的熒光探針可以與之結合，并且被切除釋放。其判斷過稱為加入i1，熒光輸出。NOT型邏輯門（圖c所示）。當加入i6時，環

12、狀結構打開，熒光結合的寡核苷酸探針無法結合在互補區域，于是無熒光輸出。其判斷過程為加入i6，熒光輸出停止。AND型邏輯門（圖d所示）實際上是將兩個YES型邏輯門組裝在一起。也就是說，只有當i1和i6都被加入時，才能有熒光輸出。AND-AND-NOT型邏輯門（圖e）是更為復雜的組合體。必須同時加入i1和i3，才能輸出熒光。然而，只要有i6存在，就不會輸出熒光。文中解決的問題是在33的棋盤中完成3個棋子同線相連。考察所有的邏輯情況后，將所有可能的邏輯門都提前置于棋盤的網格中。再將代表棋子的寡核苷酸分別放入，然后觀察熒光輸出情況進行判斷。2.3與DNA鏈置換相結合的熒光技術該技術多用來構建DNA邏輯

13、門。其巧妙利用DNA分子的粘貼，通過加入引發鏈，來釋放另一DNA鏈。在邏輯計算中，這種技術具有循環性、自引發性、反饋性、靈敏性和準確性等特點。近年來在science等高水平科研雜志上都發表了大量系列工作，而且在生物檢測領域具有廣泛的實際應用前景。2000年，BernardYurke構建了一種DNA鏈置換機器，在置換過程中可以實現閉合式運動12。2003年，B.Yurke等構建了一種基于DNA鏈置換的納米機器13。Jong-ShikShin等利用可反復的DNA鏈置換，構建了可以反復讀取和輸入的三狀態存儲器14。2006年，GeorgSeelig等對DNA鏈相互粘貼、置換的幾種模式進行了實驗15。

14、2006年，SimonJ.Green等用莖環結構實現了DNA鏈的粘貼互換16。2007年，DavidYuZhang等實現了DNA鏈置換的循環進行17。2007年,suvirvenkataraman等實現了通過DNA鏈自粘貼來完成多段DNA聚合延伸18。下面介紹兩個具有代表性的工作。2006年，Georgseelig等報道了一種沒有酶參與的DNA邏輯門19。其基本原理如圖4-1所示，即先構建好由寡核苷酸鏈G、Eout、F共同雜交組成的DNA互補結構，再加入Gin寡核苷酸鏈。此時，由于Gin一側末端和G的一側單鏈末端互補，從而使邏輯門中的G寡核苷酸鏈被釋放，與Gin形成互補雙鏈。此時的互補結構中，

15、只剩下了寡核苷酸鏈Eout和F。然后再加入Fin寡核苷酸鏈，Fin的一側末端與F中間有互補序列，加之Eout本身形成的是單鏈環狀的不穩定結構，于是，F和Fin結合成雙鏈。Eout寡核苷酸鏈被釋放。文中使用了熒光標記地對Eout的釋放情況進行了檢測（如圖4-2所示）。Eq末端標記有熒光基，而Ff末端標記有熒光淬滅基。當其互補結構存在時，熒光恰被淬滅，從而無法檢測。但是，當Eq和Ff分離時，熒光就被釋放出來，從而表明DNA鏈的分離情況。上述由G、Eout、F的DNA互補結構就可以構成與門。也就是說，只有同時加入Gin和Fin，才能誘發釋放出熒光。值得注意的是，文章并不只是提出這種DNA計算邏輯門，

16、而是將其應用到生物基因檢測的中。在鼠腦總RNA中，成功的檢測了數個基因的表達情況。圖4-1鏈置換原理示意圖圖4-2熒光標記原理示意圖2008年，PengYin等對這種DNA自粘貼、鏈置換進行了更為精細的研究20。其主要原理是利用DNA莖環結構的鏈置換。如圖5-1所示，莖環結構A是由at、a、b、bt、ct、c等DNA序列構成的，在莖環結構末端有未互補的單鏈DNA區域。如果加入與末端單鏈DNA互補的序列，整個莖環結構就會打開（圖中的at與at*可以互補，其它同理）。因此，當體系中只加入A、B這兩種莖環結構時，相互之間無任何影響。但是，當體系中加入了寡核苷酸鏈I后，就觸發了整個循環。I先和A末端互

17、補，使得A的莖環結構打開。此時，A的Bt區域與B的Bt*相互作用，使得B的莖環打開。當B完全打開后，B的a*區域會與I競爭A的a區域形成互補結構。被置換掉的I就可以重新激發新的循環。在上述基礎之上，PengYin等設計了多種復雜結構的實驗：直線型、回路型、支架型、自動位移型（見圖5-2）。直線型指I與A、B、C組件是逐級觸發，形成串聯關系。回路型指參與的激發物在循環結束后又被釋放，從而再次作用于系統。并且構建了多個循環相互鑲嵌的復雜體系。支架型指在整個觸發過程中，不僅是線性的作用方向，而且是向二維平面的擴展。自動位異型則是用鏈置換實現了特定DNA序列的位移。在這些實驗中，熒光技術發揮了重要的作

18、用。其中主要是將熒光基標記在莖環的一端，另一端則標記有熒光淬滅基。只有莖環結構打開，才能夠檢測到相應的熒光。根據標記不同的熒光，可以了解整個循環的反應速度，和反應程度。尤其是在自動位移型實驗中，通過檢測熒光，可以得知特定DNA序列在特定時間移動的位置。圖5-1莖環結構DNA置換原理回路型直線型自動位移型支架型圖5-2幾種復雜類型：直線型、回路型、支架型、自動位移型2.4與基因沉默技術相結合的熒光DNA邏輯門2007年，keller等創造性地使用活體細胞，利用RNAi技術，通過控制特異基因的表達，構建多重邏輯門。這種技術將DNA計算和基因表達、疾病診療有機的結合在一起，為DNA計算的應用指出了另

19、一方向21。RNAi技術是近年來發展起來的特異性沉默基因技術，其基本原理就是將想敲除的基因序列或者部分序列構建到特定載體中，經過轉錄，形成部分序列的反義RNA（還可以通過直接加入特異的反義短寡核苷酸進行基因敲除）。這些RNA很快就可以被酶解為小片段，并與相關的蛋白質形成復合體。于是，這種復合體就可以根據RNA來識別特定的mRNA，從轉錄水平消除特定基因。keller等利用載體序列的線形串聯排列以及基因表達的調控原理（非翻譯區UTR對下游基因轉錄的影響），構建了多個邏輯門模型。（1）或門，如圖6-1a所示，mRNA1和mRNA2分別與熒光蛋白基因串聯。這兩個mRNA只要有一個正常轉錄表達，就會有

20、熒光蛋白輸出。因此，形成了“或”的關系。（2）與門，如圖6-1b所示，TargetA、TargetB序列是串聯分布。假設有A、B兩種內源物分別抑制siRNA-A和siRNA-B對TargetA、B的影響。那末只有同時加入A、B時，才能完全抑制RNAi作用，也就是說，此時熒光蛋白才能正常表達。因此A和B形成“與”的關系。（3）非門，如圖6-1c所示，假設內源物A對siRNA-NOT（A）有激活作用。當加入A后，將會抑制Target-NOT（A）的表達，此時直接導致熒光蛋白產物的減少。將這些簡單的邏輯門組合起來，就可以實現復雜的邏輯運算，如（AANDCANDE）OR（NOT（A）ANDB），見圖6

21、-1d。首先確定A、B、C、E與各個siRNA之間的關系，如：加入A抑制siRNA-A，促進siRNA-NOT（A）。當A、B、C、E共同作用時，就可以根據基因排列的線性關系自動進行邏輯判斷。圖6-1RNAi邏輯門示意圖在上述一步完成的RNAi邏輯門的基礎上，還構建了二層邏輯門。所謂一步完成是指加入的siRNA直接發生作用，降低熒光基因的表達。而二層邏輯門是指首先調控一級蛋白質產物，再由一級蛋白質來調控二級熒光蛋白基因的表達。如圖a所示，構建了AND運算邏輯門。mRNA1和mRNA2的表達都下降才能最大限度地減少Lac抑制子的表達，從而減小Lac抑制子對熒光蛋白的表達抑制。這種多層邏輯門與細胞

22、內的蛋白、基因調控極為相似，因此在疾病診療方面有著廣闊的應用前景。圖6-2二層邏輯門示意圖2.5與DNA自組裝立體結構相結合的熒光技術DNA自組裝是近期發展迅速的領域，也是具有應用前景的領域。其涉及編碼、雜交、空間結構設計等多個方面。從自組裝結構上分，自組裝可分為一維線段結構、二維平面結構和三維立體結構。在DNA自組裝結構的基礎上，結合熒光標記技術，發展了很多精巧的DNA三維結構，如2008年RussellPGoodman等構建的四面體，其邊還可以產生熒光標記的可伸縮莖環22。這些三維結構不僅僅包含有圖像、結構信息，而且還能隨著結構的變化應用于納米技術、藥物載體、DNA計算等方面。2008年Y

23、ossiWeizmann等的工作是將DNA自組裝和熒光技術緊密結合的一個例子23。首先，利用DNA分子互補，將兩環相接觸部分的DNA序列設計為互補，雜交后再經連接酶連接，就形成了穩定的環鏈結構。通過AFM電鏡檢測，也能夠看到環鏈結構的存在。另外，將一個環狀寡核苷酸固定在有金包被的AFM電鏡感應頭上，而與其有互補序列的寡核苷酸則被固定在鍍有金的玻璃板上。當雜交并且被連接后，其感應力較未被連接有了顯著提高，側面說明環套結構的存在。在此基礎上，還設計了將DNA環分別固定在兩個金微粒（1.4nm）上，然后利用內切酶進行切割分離的實驗。實驗結果證明，這些操作都可以在環套結構上成功實現。除了上述電鏡檢測外

24、，YossiWeizmann等還利用熒光技術進行了一系列實驗。首先，如圖A所示，將四甲基羅丹明標記在短寡核苷酸上，通過雜交，形成環套和多個短寡核苷酸復合物。在電鏡下，可以觀察到柱狀熒光條帶。然后，使用四甲基羅丹明標記的凝血酶，當凝血酶結合在環套的側面時，利用AFM電鏡就可以觀察到熒光條狀DNA，并伴有多節膨大結構。同時，還對環套結構進行了類似的雙熒光探針雜交，結果發現產生了熒光共振能量轉移。因為只有當兩個熒光基和淬滅基的距離小于5nm時，才會出現能量轉移，因此，也說明環套結構是有序排列存在的。圖7-1環鏈結構組成圖7-2熒光段寡核苷酸和凝血酶標記的環鏈圖7-3DNA盒子蓋開閉示意圖2009年E

25、bbeS.Andersen等巧妙地將DNA熒光技術應用在檢測納米裝置開啟和閉合24。為了檢測DNA分子納米盒子的蓋子的開閉，分別在蓋子和盒體上標記了Cy3和Cy5熒光染料（見圖7-3）。當加入“鑰匙”DNA鏈時，盒子蓋打開，兩個熒光分子分開。此時，Cy3的熒光信號增加，而Cy5熒光信號下降。在該實驗中，利用熒光信號增減可以有效地檢測DNA納米裝置的空間變化。2.6與DNA變構相結合的熒光技術通過DNA分子的不同狀態，構建可控的熒光納米裝置。隨著DNA分子的變構，其熒光強度也隨之變化。因此，通過檢測熒光強度就可以知道DNA分子的構象變化。1999年，Mao等構建了一種基于DNA分子變構的納米裝置

26、25。其應用的原理就是B、Z型DNA的相互轉換。B-DNA就是我們所熟悉的右手螺旋結構。但是，對于含有多個GC的重復序列，當離子濃度發生變化時，就會伸展為左旋結構。如圖8-1所示的DNA復合結構是由三條鏈組成的。其中，藍色的兩條鏈相同。在每個連接的轉折處都由4的相連的T組成。在這個復合結構的中部，也就是黃色標記的序列，其中含有多個GC的重復序列。當改變離子濃度時，該區域就會伸展成為左旋結構。將熒光發射基和接收基固定在如下所示位置（圓點）。那末只有當復合結構是B-DNA時，才能通過能量轉移激發出熒光。當其為Z-DNA時，由于兩個基團距離加大，從而無法實現能量轉移。圖8-2為B、Z型DNA轉換時其

27、能量轉移的變化。圖8-1DNA復合結構變構示意圖圖8-2DNA轉換時其能量轉移3近期熒光技術的新發展熒光技術發展速度很快，在DNA計算、信息學、物理學等諸多領域具有很大的應用潛力。下面介紹幾種近年來發展起來的新型熒光技術，希望能為DNA計算提供新的思路。（1）熒光分子信標信號放大技術；（2）與磁珠技術相結合的熒光技術（3）與PH值變化相結合的DNA熒光技術；（4）與miRNAs檢測相結合的熒光技術。3.1熒光分子信標信號放大技術分子信標技術是目前較為成熟的技術，尤其是在檢測方面有著重要的應用。但是當檢測物很少時，分子信標產生的熒光就不足以被檢測，甚至發生錯誤信號。2008年，GaryKGeis

28、s等報道了一種基因表達的多色熒光分析系統26。其中使用了固定化、探針捕捉、多色熒光標記等多種技術。2005年，ErnestK.Lewis等設計了能同時激發多種熒光的方法，使得DNA檢測速度以及準確度都大大提高27。2008，JianweiJefferyLi等提高了熒光分子信標的信號強度28。其原理（如圖9-1所示）就是先通過普通的分子信標雜交過程，待分子雜交產生熒光信號后，此時，加入特異的缺刻DNA酶，即將因雜交而展開的分子信標切斷，并釋放。從而，再進行新的一輪分子信標雜交釋放。那末熒光信號就會積累增多。在此基礎上，還建立了一種加強型熒光分子信標信號放大技術（如圖9-2所示）。首先，與目標片斷

29、互補的單鏈DNA雜交，再使用連接酶進行連接成環。隨后，利用DNA聚合酶29以環狀DNA為模板，加入單引物進行PCR。在隨后擴增的線性模板上，就含有多處目標片斷。此時，再進行上述的熒光分子信標信號放大。就可以大大提高信號強度。圖9-1熒光信號積累原理圖9-2加強型熒光分子信標信號放大原理3.2與磁珠技術相結合的DNA檢測熒光技術磁珠技術，使得DNA分子的捕捉和釋放變為可能。通過DNA特異性雜交，可以特異性的獲取DNA分子。2005年，HuiXu等就將磁珠技術與熒光技術相結合，建立新型的DNA檢測系統29。首先，將標記生物素的DNA1與磁珠相結合。通過目標DNA3，可以使DNA1、2、3相互雜交，

30、形成復合體。在DNA3上標記有熒光集團。通過磁珠分離，將捕獲的DNA2和目標DNA3洗脫。由于DNA分子本省帶有負電荷，于是可以與帶有正電荷的水溶性聚乙烯（被標記有特殊基團）吸附。此時就會產生能量轉移，從而產生熒光，并被檢測（如圖10所示）。圖10與磁珠技術相結合的DNA檢測熒光技術原理3.3與PH值變化相結合的DNA熒光技術DNA的構象會隨著PH值的變化而改變。利用這一特性，2005年，DongShengLiu等構建了一種隨PH值變化的DNA熒光裝置30。整個裝置是由DNA寡核苷酸陣列構成的。在每個寡核苷酸的5端標記有-SH，隨后是由-CCCC-4個胞嘧啶組成的DNA序列，在3端標記有若丹明

31、綠色熒光基團。每個DNA寡核苷酸被固定在金表面。當PH值較低時（4-9之間），有些胞嘧啶會發生質子化，從而與其他胞嘧啶產生分子間非經典配對。此時，寡核苷酸鏈就會形成蜷縮狀結構，而不會與互補鏈雜交（如圖11-1所示）。在這種狀態下，熒光集團非常靠近金表面（約1nm），此時就不能被激發光激發。隨著PH值的增大，胞嘧啶質子化程度降低，其分子間非經典配對也隨之降低。若加入互補鏈，在金表面，展開的寡核苷酸會與互補鏈雜交，使得寡核苷酸3端的熒光集團遠離金表面（約8nm）。當有激發光激發時，就會產生綠色熒光，實驗還證實這種熒光的變化是可逆的。通過控制PH值，可以有效地進行熒光變化。圖11-1原理圖圖11-2

32、隨著PH值熒光可逆地進行變化。a：PH值4.5；b：PH值9.0；：PH值4.5；：PH值4.5；3.4與miRNAs檢測相結合的熒光技術miRNAs在真核生物的調控中發揮著重要的作用。但是miRNAs的含量很低，檢測起來比較困難。結合DNA寡核苷酸微列陣技術、熒光技術、酶切、酶聯技術，2004年PeterTNelson等發明了一種稱為RAKE的檢測miRNAs的方法31。首先建立寡核苷酸微列陣。每個寡核苷酸由三部分組成：支架序列、數個胸腺嘧啶、特異性miRNAs的互補序列。將寡核苷酸鏈5端共價連在芯片玻璃表面。其次，當miRNAs特異性雜交在寡核苷酸上時，用核酸外切酶處理，將沒有特異性雜交上

33、miRNAs的寡核苷酸鏈降解。此時保留下來的寡核苷酸上都雜交有miRNAs。與此同時，使用DNA聚合酶Klenow，以miRNAs為引物，以保留下來的寡核苷酸鏈為模板，再加入共價連接有生物素的dATP進行擴增。最后，加入共價連接有熒光基團的鏈合霉素，使其與連接有生物素的DNA鏈結合。通過激發熒光，保留下來的、并被擴增了的寡核苷酸區域就會發出熒光。其熒光量的多少，還能顯示該miRNAs量的多少。圖12RAKE原理示意圖4展望在生物技術高速發展的今天，DNA計算的研究也是日新月異。近年來，在高水平科學研究刊物上，發表了大量DNA計算方面的研究成果。DNA計算一直是世界科研領域的研究重點和熱點。DN

34、A計算發展至今，已經從開始的實驗階段逐漸轉入實用階段；從單一型技術逐漸發展為多元化技術；從簡單的結構逐漸擴增為復雜結構。熒光技術作為一種生物技術，其發展較早，且應用廣泛。因其體積小，便于標記，反應速度快，變化靈敏，所以在核酸標記和檢測方面有著得天獨厚的優勢。對于DNA計算這種精細化、定量化、復雜化的發展，熒光技術的種種特性都可以滿足并適用于DNA計算的發展。比如近兩年，關于DNA鏈置換熒光技術的研究，這種鏈置換過程都屬于單分子間的變化，如果使用常規生物實驗手段根本無法實現。而熒光技術的單個分子標記，熒光激發和湮滅性質，及其實時超高靈敏性檢測都表明其在DNA計算中的天然優勢。因此，熒光技術的進步

35、必然推動DNA計算的發展。同時，熒光技術在DNA計算的應用也拓寬了其自身應用領域。這種跨學科、跨領域的融合貫通是推動整個科學前進的原動力。一方面，應該關注熒光技術與其他生物技術（如基因芯片技術、磁珠技術等）最新的發展和聯系；另一方面，必須深刻的認識和了解計算科學所亟需解決的重要問題。只有充分的將兩個方面有機地結合，通過提出創造性想法，才能將DNA計算轉變為實用、穩定的計算手段；才能發揮DNA計算天然的優勢.參考文獻許進等.DNA計算機原理、進展及難點()分子生物計算中的數據結構與特性.計算機學報，2007，30（6）：869-880HaoYan.NucleicAcidNanotechnolog

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