1、 層析理論及技術1. 層析（chromatography）： 層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography）。層析法是一種基于被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數(shù)（或稱分配常數(shù)）不同，達到彼此分離的目的。1 層析系統(tǒng)分為兩個相：固定相和流動相。由于各組分受固定相的阻力和受流動相的推力影響不同，各組分移動速度也各異，從而使各組分得以分離。此法首先用于有色物質的分離

2、，故又稱色層析法。 層析法是近代生物化學最常用的分析法之一，此法可以分離性質極為相似、而用一般化學方法難以分離的各種化合物，如各種氨基酸、核苷酸、糖、蛋白質等。22. 層析的分類：2.1根據(jù)兩相所處狀態(tài)：氣相層析；固相層析2.2根據(jù)層析分離機制：吸附層析；分配層析；離子交換層析；凝膠層析；親和層析2.3根據(jù)操作形式不同：柱層析；薄層層析；紙層析；薄膜層析3.常用層析方法：3.1薄層層析：薄層層析法是吸附劑在玻璃板上均勻地鋪成薄層，把要分析的樣品點加到薄層上，然后用適當?shù)娜軇┱归_，而達到分離、鑒定的目的。其優(yōu)點是：設備簡單，操作容易；層析展開時間短，分離時幾乎不受溫度的影響；可采用腐蝕性的顯色劑

3、，且可以在高溫下顯色；分離效率高。3.2紙層析:3.3凝膠層析：33.4親和層析：生物體中許多高分子化合物具有與某些對應的專一分子可逆結合的特性，例如，酶、蛋白與輔酶，抗原與抗體、酶與酶抑制劑、激素與受體等體系，都具有這種特性。生物高分子與配體之間形成可解離的專一絡合物的能力稱為親和力。根據(jù)這種具有親和力的生物高分子與配基間可逆性結合和解離的原理而建立的層析技術稱為親和層析（affinity chromatography）。親和層析的優(yōu)點是：在溫和條件下進行，操作簡單，效率高。親和層析在分離、純化的效率上可以說是最佳的方法。435離子交換層析法（ion exchange chromatogra

4、phy IEC）是利用離子交換劑對需要分離的各種離子有不同的親和力而達到分離的目的，這種柱層析稱為離子交換層析。 離子交換劑是通過化學反應將帶電荷基團引入惰性支持物上而形成。離子交換作用是指一溶劑中某一種離子與一固體中的另一種具有相同電荷的離子進行相互位置的調換。由于各種離子所帶電荷的多少不同，它們對交換劑的親和力就有所差別。 5實驗七：血紅蛋白與核黃素的凝膠層析 6實驗性質：分析性目的要求：1.了解凝膠層析法的基本原理應用 2.掌握凝膠柱層析的基本操作71.概述： 凝膠層析又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析等。它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品中各個組分

5、的液相色譜方法。 1959年，Porath和Flodin首次用一種多孔聚合物交聯(lián)葡聚糖凝膠作為柱填料，分離水溶液中不同分子量的樣品，稱為凝膠過濾。1964年，Moore制備了具有不同孔徑的交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，能夠進行有機溶劑中的分離，稱為凝膠滲透層析（流動相為有機溶劑的凝膠層析一般稱為凝膠滲透層析）。隨后這一技術得到不斷的完善和發(fā)展，目前廣泛的應用于生物化學、高分子化學等很多領域。8 凝膠層析是生物化學中一種常用的分離手段，它具有設備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復性好、特別是不改變樣品生物學活性等優(yōu)點，因此廣泛用于蛋白質（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應用于蛋白質分子量

6、的測定、脫鹽、樣品濃縮等。92.實驗原理2.1凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質進行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內部具有立體網狀結構，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴散到孔穴內部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動相向下流動，它們經歷的流程短，流動速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內部，經歷的流程長，流動速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之間的分子在流動中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子

7、的大小，所以它們流出的時間介于二者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。10凝膠過濾分離蛋白質112.2 固定相：交聯(lián)葡聚糖（sephadex G-50）2.3 流動相：蒸餾水2.4 待分離物質：血紅蛋白（紅色，MW: 64500）核黃素（黃色，MW: 376）2.5 血紅蛋白因為分子量較大，洗脫較快；核黃素則較慢123. 操作：3.1凝膠準備：sephadex G-50 1g加蒸餾水30ml煮沸1h，冷卻3.2柱體積測定：3.3裝柱：關閉出口，加1/3柱蒸餾水；將混勻凝膠倒入，凝膠沉積后打開出口，排出部分蒸餾水，同時，不斷加入凝膠，直至凝膠體積占柱體積的1/2至2/3。（注意：凝膠中防止出現(xiàn)汽泡和斷層，凝膠面要平整）3.4加樣：打開出口，使蒸