1、1第6章 酶工程制藥2第一節 概述一、酶工程簡介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶學和工程學相互滲透結合、發展而形成的一門新的技術學科。它是從應用的目的出發研究酶、應用酶的特異催化性能，并通過工程化將相應原料轉化成有用物質的技術。3二、現代酶工程的主要內容：1.酶的分離純化、大批量生產及新酶和酶的應用開發；2.酶和細胞的固定化及酶反應器的研究，包括酶傳感器、反應檢測；3.酶生產中基因工程技術的應用及遺傳修飾酶的研究；4.酶的分子改造和化學修飾，結構與功能的研究；45.有機相中酶反應的研究；6.酶的抑制劑、激活劑的開發與應用研究；7.抗體酶、核酸酶的研究；8.模擬酶、合成酶及酶

2、分子的人工設計、合成研究。5三、酶的來源 酶的來源：酶的生產目前多數直接從生物體中提取分離。非常少的是合成,基因工程.早期酶的生產多以動植物為主要原料，如激肽釋放酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年來，研究發展了動植物組織培養技術，但周期長、成本高。工業生產一般都以微生物為主要來源。目前使用的千余種商品酶，大多數是微生物生產的。6第三節 酶和細胞的固定化（一）固定化酶的制備1、固定化酶（immobilized enzyme）的定義:指限制或固定于特定空間位置的酶。具體講是指經物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發揮催化作用的酶制劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固

3、定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以是結合在菌體（死細胞）或細胞碎片上的酶或酶系。7什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術8 2、固定化酶的特點（1）可以多次使用，酶的穩定性提高；（2）反應后，酶與底物和產物易于分開，產物中無殘留酶，易于純化。（3）反應條件易于控制，可實現轉化反應的連續化和自動控制；（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更適合于多酶反應。9化學偶聯酶固定化間歇可溶交聯包埋吸附間歇連續（一）傳統的酶固定化方法1011（1）載體結合法：將酶結合于不溶性載體上的固定化方法。A.物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體

4、上的固定化方法?；钚蕴?多孔玻璃,樹脂等優點：操作簡單，可選用不同電荷和不同形狀的載體，有可能固定化和純化過程同時實現，酶失活后載體仍可再生。缺點：最適吸附酶量無規律可循，吸附量與酶活力不一定呈平行關系，酶與載體結合力不強，酶易于脫落，導致酶活下降并污染產物。12 B、離子結合法：酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的水不溶性載體上。DEAE-纖維素等優點：操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結構和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞。缺點：載體和酶的結合力弱，易受緩沖液種類或pH的影響，離子強度高時，酶易脫落。13C、共價結合法：酶以共價鍵結合于載體上。即將酶分子上非活性部位功能團與載體表面反應基團進行共

5、價結合的方法。優點：酶與載體結合牢固，穩定性好，不易脫落。缺點：載體要活化，反應條件苛刻，操作復雜，反應條件劇烈，酶易失活和產生空間位阻效應。14（2）交聯法：用雙功能或多功能試劑使酶與酶或細胞與細胞之間交聯的方法。交聯法又分：交聯酶法、酶與輔助蛋白交聯法、吸附交聯法和載體交聯法。常用的交聯劑：戊二醛、雙重氮聯苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。15酶分子之間共價交聯和與水不溶性載體共價偶聯 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯試劑相互交聯成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶16（3）包埋法：A、網格型：將酶或細胞包埋在高分

6、子凝膠細微網格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂。天然高分子化合物有淀粉、明膠、膠原、海藻膠、角叉菜膠。多用于固定化細胞17B、微囊型：將酶或細胞包埋在高分子半透膜中。通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體。顆粒比網格型要小得多，比較有利于底物與產物的擴散，但反應條件要求高，制備成本也高。1819（二）新型的酶固定化方法溫和的條件下進行，減少酶活力損失，提高固定化效率光偶聯法：光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團的載體共價固定化酶等離子體法：高度激發的原子、分子，自由基的聚集體，載體表面用等離子體修飾，引入活性基團偶合固定法：幾種固定化方法或載體的聯合應用20無載體固定

7、化酶直接用交聯劑交聯 用交聯劑交聯溶解酶、晶體酶、物理聚集酶、和噴霧干燥酶等四種無載體酶體系，優點如下： 1.催化活性高，成本低 2.具備較高的催化劑比表面 3.可加入多種酶 4. 底物擴散受限制少 5.極端條件下穩定性高21（三）固定化細胞的方法1.固定化細胞的定義 將細胞限制或定位于特定空間位置的方法.第二代固定化酶. 不用載體，通過化學或物理的手段使細胞彼此附著相連 另外還有載體粘合，金屬螯合等多種方法222、固定化細胞的制備技術（1）載體結合法制備技術：將細胞懸浮液直接與水不溶性載體相結合。載體主要為陰離子交換樹脂、陰離子交換纖維素、聚氯乙烯。 優點：操作簡單，符合細胞的生理條件，不影

8、響細胞的生長及酶活性。 缺點：吸附容量小結合強度低。（2）包埋法制備技術：與包埋酶法相同。23（3）交聯法制備技術：由于所用交聯劑戊二醛等對細胞有毒性，一般很少用。（4）無載體法制備技術：靠細胞自身的絮凝作用制備固定化細胞的技術。通過助凝劑或選擇性熱變性的方法實現細胞的固定化。此外還有粘合法，截留法等24（四）常用的固定化酶載體材料1.固定化酶載體材料的性質要求(1)功能基團(2)滲透性和比表面：大的比表面和多孔結構(3)溶解性：要求不溶于水(4)機械剛性和穩定性：(5)組成和粒徑：孔徑小(6)對微生物的抵抗性(7)經濟環保252.固定化酶載體材料(1)高分子載體1)天然高分子材料：優點：無毒

9、，傳質性好缺點：易被微生物降解一般用殼聚糖，海藻酸鈉 261)合成有機高分子材料：強度大，抗微生物降解聚苯乙烯27(2)無機載體穩定性好，機械強度高，不易降解，耐酸，成本低，壽命長玻璃，硅凝膠，鋁等28（3）復合載體：無機有機材料復合組成的新型載體磁性高分子微球:內部含有磁性金屬或金屬氧化物的超細粉末。回收簡單（4）新型載體：如光敏293、固定化方法的選擇（1）固定化酶應用的安全性：要按照藥物和食品領域的檢驗標準作必要的檢查。所用試劑是否有毒性和殘留。盡可能選擇無毒性試劑。（2）固定化酶在操作中的穩定性：在選擇固定化方法時要求固定化酶在操作過程中十分穩定，能長期反復使用，在經濟上有極強的競爭力

10、。（3）固定化的成本：包括酶、載體、試劑的費用，也包括水、電、氣、設 備和勞務投資等。304、載體的選擇為了工業化應用，最好選擇工業化生產中已大量應用的廉價材料為載體，如聚乙烯醇、卡拉膠、海藻膠等。離子交換樹脂、金屬氧化物及不銹鋼碎屑等都是有應用前途的載體。此外，載體的選擇要考慮底物的性質，如當底物為大分子時，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不銹鋼屑或陶瓷材料制備固定化酶，以便實現轉化反應和回收固定化酶。31二、固定化酶（細胞）的性質與指標1、固定化酶的形狀（1）顆粒狀：包括酶珠、酶塊、酶片、酶粉。每種固定化方法均可制備顆粒狀，方法簡單，比表面積大，

11、轉化效率高，適用各種反應器。如酵母酶珠。（2）纖維狀：三醋酸纖維素用適當的溶劑溶解后與酶混合，再用噴絲的方法就可制成酶纖維。比表面積大，轉化效率高，但只適用于填充床反應器。此外，纖維酶可以織成酶布用于填充床反應器。32（3）膜狀固定化酶：可通過共價結合的方法將酶偶聯在濾膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面積大，滲透阻力小，可用于酶電極，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、脲酶等酶膜。（4）管狀固定化酶：又稱酶管，利用管狀載體如尼龍、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，經活化后與酶偶聯得酶管。酶管的機械強度大，切短后可用于填充床反應器，也可組裝成列管式反應器。目前已制備出糖化酶

12、、轉化酶、脲酶 等酶管。332、固定化酶的性質 （1）酶活力的變化：酶經過固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸與載體發生結合，酶的空間結構發生變化或酶與底物結合時存在空間位阻效應。包埋法中還有底物與產物擴散阻力增大。 （2）酶穩定性的變化：包括對溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩定性提高，有效壽命延長。其原因是限制了酶分子之間的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶構型的牢固程度。341.熱穩定性提高：熱穩定性越高，工業化意義越大。熱穩定性高可以提高反應溫度和反應速度，提高效率。2.對有機試劑及酶抑制劑的穩定性提高3.PH，蛋白酶等穩定性提高35A、操作穩

13、定性：通常半衰期達到1個月以上時，即具有工業應用價值。B、貯藏穩定性：一般不能長期貯存，現做現用，否則活力逐漸下降。若需長期保存，可在貯存液中添加底物、產物、抑制劑和防腐劑，并于低溫保存。C、對蛋白酶的穩定性：大多數天然酶經固定化后對蛋白酶的耐受力有所提高?？赡艿脑蚴怯捎诳臻g位阻效應使蛋白酶不能進入固定化酶內部。36（3）酶學特性的變化 A、底物專一性：對底物的專一性下降。 B、最適pH：最適pH可能變大，也可能變小；pH-酶活曲線可能發生變化，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質有關。 C、最適溫度：一般升高。原因是固定化后空間結構更為穩定。 D、米氏常數(Km) ：Km值均發生變化，有的增加很

14、小，有的增加很大，但不會變小。 E、最大反應速度（Vm）：變化很小或不變。37(4)評價固定化酶（細胞）的指標1.固定化酶活力測定單位;每毫克干重每分鐘轉化底物的量活力回收率=固定化酶總活力/加入酶的總活力相對活力固定化酶總活力/（加入酶的總活力上清液中未偶聯的酶活力）2.偶聯率及相對活力的測定偶聯率（加入酶活力上清液酶活力）/加入蛋白活力383.半衰期，即酶的活力降為初活力一半時所經歷的連續操作時間。T1/2表示4.熱穩定性：將固定化酶在不同溫度下溫育1h，在最適溫度下測酶活力，一般保持在60%以上39第四節 固定化酶和固定化細胞的反應器用于酶進行催化反應的容器及其附屬設備稱為酶反應器。酶催

15、化反應過程示意圖過程調控生物反應器 消毒原料預處理 產物分離提純 產品生物催化劑制備空氣除菌能量熱量40常見的酶反應器類型按結構區分攪拌罐式反應器（Stirred Tank Reactor, STR）鼓泡式反應器(bubble column reactor, BCR )填充床式反應器(packed column reactor, PCR )流化床式反應器( Fluidized Bed Reactor, FBR)膜反應器(Membrane Reactor, MR) 按操作方式區分分批式反應(batch )連續式反應(continuous )流加分批式反應(feeding batch ) 混合形式

16、連續攪拌罐反應器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）分批攪拌罐反應器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR） 41一、反應器的類型和特點間歇式攪拌罐反應器用于游離酶反應后隨即放料。又稱為批量反應器（Batch Reactor BSTR）。特點：底物與酶一次性投入反應器內，產物一次性取出；反應完成之后，固定化酶（細胞）用過濾法或超濾法回收，再轉入下一批反應。 42優點：裝置較簡單，造價較低缺點：固定化酶經反復回收使用時，易失去活性，故在工業生產中，間歇式酶反應器很少用于固定化酶，但常用于游離酶。43連續流動攪拌罐反應器連續進料

17、、連續出料連續攪拌釜式反應器（CSTR）。向反應器投入固定化酶和底物溶液，不斷攪拌，反應達到平衡之后，再以恒定的流速連續流入底物溶液，同時，以相同流速輸出反應液（含產物）。底物溶液進口 反應液出口 44優點：混合良好，各部分組成相同，并與輸出成分一致。缺點：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損固定化酶顆粒。453. 鼓泡式反應器鼓泡式反應器(bubble column reactor, BCR)用于游離酶和固定化酶的催化反應。在使用鼓泡式反應器進行固定化酶的催化反應時，反應系統中存在固、液、氣三相，又稱為三相流化床式反應器。鼓泡式反應器的結構簡單，操作容易, 剪切力小，物質與熱量的傳遞效率高，是有氣體參

18、與的酶催化反應中常用的一種反應器。例如氧化酶催化反應需要供給氧氣，羧化酶的催化反應需要供給二氧化碳等。 464. 噴射式反應器利用高壓蒸汽的噴射作用，實現酶與底物的混合，進行高溫短時催化的反應器噴射罐和維持罐組成一般用于耐高溫酶的催化475. 膜反應器膜反應器（membrane reactor, MR）是將酶催化反應與半透膜的分離作用組合在一起而成的反應器。可以用于游離酶的催化反應，也可以用于固定化酶的催化反應。用于固定化酶催化反應的膜反應器是將酶固定在具有一定孔徑的多孔薄膜中，而制成的一種生物反應器。膜反應器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纖維型、轉盤型等多種形狀。常用的是中空纖維反應器。

19、4849連續攪拌罐超濾膜反應器 簡稱CSTR-UFR。在CSTR（連續式攪拌罐）出口處設置一個超濾器?？梢詫⑿》肿赢a物與大分子酶和底物分開，有利于產物回收。該反應器適用于顆粒較細的固定化酶、游離酶和細胞以及小分子產物與大分子底物。游離酶在膜反應器中進行催化反應時，底物溶液連續地進入反應器，酶在反應容器的溶液中與底物反應，反應后，酶與反應產物一起，進入膜分離器進行分離，小分子的產物透過超濾膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循環使用。506.填充床反應器（Packed Reactor,PBR） 填充床反應器。固定化酶添充于床層內。反應器內的流體的流動形態為平推流形。底物以恒定流速通過反應床.5

20、1優點是：高效率、易操作、結構簡單等，是目前工業生產及研究中應用最為普遍的反應器。它適用于各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液，以及有產物抑制的轉化反應。缺點是：傳質系數和傳熱系數相對較低。當底物溶度含固體顆粒或黏度很大時，不宜采用PBR52特點：底物溶液以足夠大的流速，從反應器底部向上通過固定化酶柱床時，便能使固定化酶顆粒始終處于流化狀態,達到混合的目的。7.流化床反應器（Fluidized Bed Reactor, FBR）53其流動方式使反應液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之間。FBR可用于處理黏度較大和含有固體顆粒的底物溶度，同時，亦可用于需要供氣體或

21、排放氣體的酶反應（即固、液、氣三相反應）。但因FBR混合均勻，故不適用于有產物抑制的酶反應。54各種反應器的示意圖55各種酶反應器的特點反應器類型適用的操作方式適用的酶特點攪拌罐式反應器分批式,流加分批式連續式,游離酶固定化酶反應比較完全，反應條件容易調節控制。填充床式反應器連續式固定化酶密度大，可以提高酶催化反應的速度。在工業生產中普遍使用。流化床反應器分批式流加分批式連續式固定化酶流化床反應器具有混合均勻，傳質和傳熱效果好，溫度和pH值的調節控制比較容易，不易堵塞，對粘度較大反應液也可進行催化反應。56反應器類型適用的操作方式適用的酶 特點鼓泡式反應器分批式流加分批式連續式游離酶固定化酶鼓

22、泡式反應器的結構簡單，操作容易，剪切力小，混合效果好，傳質、傳熱效率高,適合于有氣體參與的反應。膜反應器連續式游離酶固定化酶清洗比較困難 噴射式反應器連續式游離酶通入高壓噴射蒸汽，實現酶與底物的混合，進行高溫短時催化反應，適用于某些耐高溫酶的反應57二、反應器性能評價固定化酶的形狀 溶液酶,回收困難,只適用于BSTR 顆粒及片狀的固定化酶對CSTR和PBR均適用 膜及纖維片狀的酶只適用PBR 固定化酶易變形,易粘及結顆粒時,采用FBR58底物的物理性質 溶解性和濁液性底物.適合任何反應器 顆粒和膠狀底物需要高速攪拌反應的動力學特性 CSTR型隨攪拌速度,PFR型隨流速增加而加快59酶的穩定性

23、高速攪拌會脫落,避免剪切力,減少外界環境影響.60三、酶反應器的操作1.酶反應器操作條件的確定及其調節控制（1）底物濃度的確定與調節控制底物濃度是酶催化速度的關鍵因素要確定適宜的底物濃度，過低，反應速度慢，過高，粘度大61（2）酶濃度的確定與調節控制底物粘度足夠高時，酶反應速度與與酶濃度成正比考慮成本，保持一定的酶濃度，進行補充和替換62（3）反應溫度的確定與調節控制需最適用溫度，控制在范圍內溫度變化時，及時調節63（4）PH的確定與調節控制最適PH在操作過程中，有時需要用酸或堿來調節反應液PH。如果局部的pH過高或過低，就會引起酶的失活，或者使底物和產物發生水解反應。這時，可用加快攪拌已促使

24、混合均勻。64（5）攪拌速度的確定與調節控制混合均勻，有效碰撞攪拌過慢，影響混合均勻性，過快，剪切力過大65（6）流動速度的確定與調節控制連續式酶反應器中，控制好流速，保證混合均勻，過慢，酶顆粒沉積，阻塞；過快，流動狀態過亂，固定化酶結構破壞，脫落，流失填充床式，流速越慢，酶與底物接觸時間越長，反應越完全，但生產效率低，過快，影響轉化效率膜反應器，容易產生濃差極化阻塞膜孔，需攪拌和控制流速66 2.酶反應器應用的注意事項（1）保持酶反應器的操作穩定性：一定時間后，檢查酶活力，進行補充和替換（2）保持流體的流動方式和狀態：流動狀態的改變，會影響酶與底物，產物的接觸（3）防止酶的變性失活:控制溫度，PH，金屬離子，剪切力67（4）防止微生物污染：一般不必嚴格無菌操作，但底物與產物為營養物時，需防微生物污染。 一般要符合必要的衛生條件，生產藥用或食品酶時，衛生條件要求較高68措施：要求環境清潔，反應器使用前后進行清洗和消毒嚴格管理，經常檢測加消毒劑等采用較高溫度和低的PH693.生產能力的下降及對策酶反應器操作中，生產能力逐漸降低，主要原因是固定化酶活性降低或損失。造成固定化酶活性損失的原因：（1）酶本身的失活；（2）酶從載體上脫落；（3）載體的破碎或溶解。70固定化酶產品介紹(1)氨基酰化酶：這是世界上第一種工業化生產的固定化酶，可以用于生產各種L-氨基酸藥物。1