1、項目四 絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備1 SHMT電泳制備方案的制定11212011423225第六組張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備簡介聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（acrylamide，簡稱Acr）和交聯劑又稱為共聚體的N, N-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，簡稱Bis）在加速劑和催化劑的作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱PAGE）。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備與其他凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠有下列優點：在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好。化學性能穩定，與被

2、分離物不起化學反應。對pH和溫度變化較穩定。幾乎無電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好。樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g。凝膠孔徑可調節，根據被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯劑的濃度調節凝膠的孔徑。分辨率高，尤其在不連續凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，因而有更高的分辨率。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備聚丙烯酰胺凝膠聚合原理及相關特性張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備2凝膠孔徑的可調性及其有關性質（1）凝膠性能與總濃度及交聯度的關系：凝膠

3、的孔徑、機械性能、彈性、透明度、粘度和聚合程度取決于凝膠總濃度和Acr與Bis之比。通常用T%表示總濃度，即100ml凝膠溶液中含有Acr及Bis的總克數。Acr和Bis的比例常用交聯度C%表示，即交聯劑Bis占單體Acr與Bis總量的百分數。 根據有關實驗研究，可知當T%值固定時，Bis濃度在5%時孔徑最小，高于或低于5%時，孔徑卻相應變大。為了在使用凝膠做實驗時有較高的重現性，制備凝膠所用的Acr濃度，Bis和Acr的比例、催化劑的濃度、聚合反應的溶液pH值、聚膠所需時間等能影響泳動率的因子都必須保持恒定。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備（2）凝膠濃度與被分離物分子量的

4、關系：由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過可移動顆粒的分子量也不同，在操作時，可根據被分離物的分子量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠（標準膠），因為生物體內大多數蛋白質在此范圍內電泳均可取得較滿意的結果。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備SDS的影響因素1. 帶電顆粒的性質凈電荷多少、顆粒大小及形狀。一般凈電荷多，直徑小而且近于球狀，則泳動速度快，反之則慢。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備2. 電場強度（電位梯度）指單位長度（cm）支持物體上的電位降，它對泳動度起著十分重要的作用。一般

5、電場強度越高，帶電顆粒移動速度越快。根據電場強度可將電泳分為低壓（常壓）電泳100500V，電場強度為210V/cm，分離時間需要數小時、數天或更長。高壓電泳5001000V，電場強度20200V /cm，電泳時間短。有時僅需幾分鐘，主要用于氨基酸、肽、核苷酸。由于電壓增高電流增大需要冷卻裝置。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備3. 溶液的PH溶液的pH值決定帶電顆粒的解離程度。也決定物質所帶凈電荷的多少。對氨基酸、蛋白質等兩性電解質而言，溶液PH值離等電點越遠，顆粒所帶凈電荷越多，電泳速度越快。反之越慢。血清中：白蛋白pI 4.0；2球蛋白 pI 5.06；球蛋白 pI 5

6、.1；球蛋白 pI 7.1。在pH 8.6的緩沖液中電泳時，都帶負電荷，其泳動速度為：白蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白。為了利于分離蛋白質混合液，應選擇一種使各種蛋白質所帶電荷差異明顯的pH值。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備4. 溶液的離子強度在保持足夠緩沖能力的前提下，離子強度要求最小。溶液離子強度越高，帶電顆粒泳動速度越慢，反之越快。通常選擇在0.050.1mol/l 之間。緩沖溶液離子強度可通過下列公式計算：I=0.5cZ2；I 溶液的離子強度； c 離子濃度； Z 離子價數。如:0.154 mol/l 的NaCl溶液的離子強度。I=0.5（0.15412+0.15412

7、）=0.154。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備5. 電滲作用在有支持物的電泳時影響電泳的另一個重要因素是電滲作用。電滲作用：在電場中，溶液對固體支持物的相對移動。電滲作用根據支持介質的不同而產生不同程度和不同方向的電滲流動。因此電滲作用與電泳速度關系密切。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備電泳基本原理蛋白質在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質比例的SDS-蛋白質多肽復合物，該復合物帶負電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質的分子量大小

8、有關，因此可以濃縮和分離蛋白質多肽。聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質多數采用一種不連續的緩沖系統，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強度也相應不同，故電泳時，樣品中的SDS-多肽復合物沿移動的界面移動，在分離膠表面形成了一個極薄的層面，大大濃縮了樣品的體積，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備張家敏

9、生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備試劑1、30%凝膠貯備液：稱取29g 丙烯酰胺（Acr）和1g 甲叉-雙丙烯酰胺（Bis），加蒸餾水至100ml，濾紙過濾貯存。2、10% SDS：稱取SDS 10g 加蒸餾水至100ml。3、10%過硫酸胺（AP）4、N，N，N，N四甲基乙二胺（TEMED）5、5電泳緩沖液：于900ml蒸餾水中分別加入15.1g Tris、94g甘氨酸、5g SDS，混勻后加蒸餾水至1 000ml。6、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)7、電泳加樣

10、緩沖液張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備器材移液槍垂直電泳槽電泳儀移液管張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備操作步驟1、配制分離膠濃度8%、體積15mlH2O 6.9ml30%凝膠貯備液 4.0ml1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml10%SDS 0.15ml10%過硫酸胺 0.15mlTEMED 0.01ml張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備2、一旦加入TEMED，混勻后立即小心地將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，為成層膠留有足夠空間。用毛細管輕輕在其頂層加入幾毫升正丁醇，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。3、

11、聚合完成之后，倒掉覆蓋液體，用去離子水洗凝膠上部數次，盡可能用吸水紙吸干頂端的殘存液體。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備4、配制5%成層膠5ml，插入梳子，小心避免混入氣泡，垂直放置室溫下。H2O 3.4ml30%凝膠貯備液 0.83ml1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml10%SDS 0.05ml10%過硫酸胺 0.05mlTEMED 0.01ml張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備5、在成層膠聚合時，將樣品與加樣緩沖液混勻，100加熱3min。6、成層膠聚合完成后，用去離子水沖洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，將凝膠放入電泳槽上。7、加