1、實驗(shyn)內容：以下四個實驗實驗(shyn)時間： 14周一至周四其中(qzhng)周1，周2開實驗1和實驗2 周3周4 開實驗3和實驗4也就是說GC-MS實驗時間為14周周一至周4下午和晚上一共有三年級和四年級共4各班。第14周星期1星期2星期3星期4下午四年級（4）四年級（5）四年級（4）四年級（5）晚上三年級（3）三年級（5）三年級（4）三年級（5） 實驗1： HYPERLINK /lsj/spsy/有關色譜參數的測試及計算.doc 色譜參數的測試及計算(色譜理論驗證性實驗)實驗2：GC-MS 用于某某揮發性成分的分析實驗3 GC-MS與保留指數聯合定性分析未知樣品實驗4 高效液相

2、色譜法測定三種胺基酸（梯度洗脫）實驗(shyn)1 HYPERLINK /lsj/spsy/有關色譜參數(cnsh)的測試及計算.doc 色譜參數的測試及計算(色譜理論(lln)驗證性實驗)一、目的要求1. 通過本實驗基本色譜參數的測試與計算，定量地了解溶質組分在色譜柱過程中熱力學和動力學作用的量度。2. 理解各色譜參數的意義及其相互關系。3. 通過本實驗進一步掌握柱效、柱選擇性、分離能力、保留值等性質，使之能選擇出最佳色譜操作條件，得到可靠的定性，定量結果。二、測定意義通過試驗，了解色譜中的各個基本參數， 從色譜圖中學會參數的獲得及各基本參數計算。在規定的色譜條件下，測定惰性組分的死時間（t

3、M）及被測組分的保留時間（tR）、半高峰寬（W1/2）、及峰高（H）等參數，便可計算出基本色譜參數值。1 調整保留時間：用公式計算出2 相對保留值：計算出(正庚烷, 正已烷)；( 乙酸正丁酯, 正已烷)；( 正辛烷, 正已烷)的相對保留值，以正已烷作標準。3 容量因子：計算出正已烷；正庚烷；乙酸正丁酯；正辛烷的K，以其中K=2-5的組分進行計算。4 理論塔板數：以其中K=2-5的組分進行計算。5 有效塔板數：以其中K=2-5的組分進行計算。當K足夠大時理論塔板數與有效塔板數是否近似相等。6 分離(fnl)度：計算出較難分離二組分的分離度。7 分離數：計算出任意(rny)二相鄰正構烷烴峰之間的T

4、Z值（即二峰間可容納的峰數）。8 保留指數：計算(j sun)出任意二相鄰正構烷烴峰之間的I值三、方法原理“塔板理論”：把色譜柱看作一個有若干層塔板的分餾塔，通過物質在每層塔板中進行平衡的物理模型過程，導引出一個描述色譜流出曲線的數學表達式：式中 c色譜流出曲線上任意一點樣品的濃度； n理論塔板數；m溶質的質量；VR溶質的保留體積，即從進樣到色譜峰極大點出現時通入色譜柱中載氣的體積；V在色譜流出曲線上任意一點的保留體積。四、儀器與試劑儀器 氣相色譜儀一套，鄰苯二甲酸二壬酯與吐溫混合固定液填充柱（DNP柱）1m3mm；微量注射器(510l)一支試劑 甲烷，正己烷，正庚烷，正辛烷，乙酸正丁酯，混合

5、樣。五、實驗步驟1聯結好儀器系統，檢查并排除故障至正常工作(gngzu)狀態2 .色譜(s p)條件=120C，=100C，i=120C；載氣H流速(li s)40 mlmin；進樣量：空氣50l，乙酸正丁酯+n-C06+n-C07 +n-C08混合樣1l；純樣進0.4l。信號衰減視靈敏度而定。3色譜條件 Tj120，Tc100，Td120；載氣：N2流速30m1min，H2流速40mlmin，空氣流速350m1min記錄儀靈敏度10mV25cm,紙速10mmmin；甲烷,乙酸正丁酯+n-C06n-C07+n-C08混合樣41，信號衰減視靈敏度狀況而定。 4測試 待儀器開啟運行至基線平穩后，取

6、純凈CH4樣品101注入GC儀器系統(如信號過大則可以適當減少進樣量)，計時，準確記錄保留時間(tM)。重復進樣510次，至tM值絕大多數重復為止。取其平均值，為本實驗的tM值tM (甲烷)。再取四種混合組分的樣品溶液4l注入儀器系統，得到較理想譜圖后，再重復進樣3 5次，取其平均保留時間為本實驗各組分的保留時間tR (乙酸正丁脂)，tR (正已烷)、tR (正庚烷)、tR (正辛烷)。 5測試結果 在儀器操作條件穩定無誤的情況下，應得到分離狀況良好的色譜圖六、數據處理1、記錄甲烷的tR值和四組分混合樣的各保留值(平均值)。令tn-1=tR(正己烷); tn=tR(正庚烷);tn+1=tR (

7、正辛烷);ti=tR (乙酸正丁酯).2測量并記錄各組分的半高峰寬Wh/23各基本參數計算：2和峰寬W值(1)調整保留時間：以t R = tR tM關系計算出tn-1、 tn 、tn+1 及ti；(2)相對保留值(ri,s)：按ri,s=t R(i)/ tM的關系，計算出正庚垸，正已垸，乙酸正丁酯，正已烷，正辛烷，正已垸(以正已烷作標準物時) (3)容量因子：根據Kt R/tM的關系，計算出K (正己烷) K (正庚烷)，K(乙酸正丁脂)，K(正辛烷)值(4)理論塔板數：以其中K=25的某組分為代表，根據n=554(tRWh/2)2或n=16(tRW)2的關系計算出柱效率(每米柱長所具有的理論

8、塔板數)(5)有效塔板數:neff=554(tRWh/2)2或neff=16(tRW)2的關系計算出有效塔板數(仍可用K=25的組分)。當K值足夠大時，nneff(6)分離度:可根據R=2(tR2tR1)/(W1+W2)關系，計算出四種組分中較難分離的二組分間的分離度;(7)分離數：可根據TZ=(tR(Z+1)tR(Z)/( Wh/2(Z) Wh/2(Z+1)的關系，計算出任意二相鄰正構烷烴峰之間的TZ值(即二峰間可容納的峰數)(8)保留指數：是色譜定性的重要指標，準確測量十分重要。只要嚴格保證色譜條件的一致性(同文獻Sandtler保留指數的色潛條件比較)，該指數可作為未知物可靠的定性指標。

9、保留指數計算可按I=100(log t R()log t R(z)/ (log t R(z+1)log t R(Z)+z的關系計算出任意二相鄰正構烷烴伺某組分的I值。如載氣流速不非常穩定時,可用VR(i), VR(z), VR(z+1),代替上述的t R()、 t R(z) 和t R(z+1)，這樣可以使I值測量更準確些。例 在上述條件下測得以下(yxi)實驗數據：乙酸(y sun)正丁酯 t R(乙酸(y sun)正丁脂)= 3.10min log3.10=0.4914正 庚 烷 t R(正庚烷)=1.74min logl.74=0.2405正 辛 烷 t R (正辛烷)=3.73min l

10、og3.73=0.5722試計算乙酸正丁酯的保留指數。解 因z=7，所以I(乙酸正丁脂)=100(0.09140.2405)/(0.57220.2405=75.6+700.0=775.6七、問題討論1色譜定性尚有一些色譜參數可以用，如tR ,t R , VR, ri,s等，為什么說用I值最可靠?因為采用保留值定性要求兩次進樣條件完全一致， 這是比較困難的，ri,s 要求溫度一定， 且需要標準物質。 保留指數定性的重現性最佳， 當固定液和柱溫一定時， 定性可不需要標準物質。一般講只要色譜柱（固定液）和柱溫相同，就可以利用文獻或手冊發表的保留指數來定性。2關于tM值的測量：從tM定義看，tM值的測

11、量規定為惰性組分從進樣開始至柱后流出濃度極大點所對應的時間，即該惰性組分不能與固定相發生任何作用(溶解或吸附)便流出色譜柱。實際上不存在這種州想的惰性組分，或多或少在柱中有保留作用，因此直接測量而得到的tM值，相對說不那么準確，特別是數值小的tM，會引入一定的誤差(而數值大的誤差往往可以略而不計)。因tM射值是諸色譜參數的基淮數據，故有許多人研究它的準確計算方法。如利用三個同系物的保留值來推算死時間，其三個同系物的碳數必須符合如下條件， CnC(ni)=C(n+i)Cn (51)又根據同系物的碳原子數與調整保留時間的對數呈線性關系而推導出來的方程式，即Cn=mlog tn +q= mlog (

12、tntM )+q (52)式中， Cn同系物中的碳原子數；tn具有Cn同系物的保留時間；tnCn同系物的調整保留時間；m、q方程式中常數。三個同系物(正己烷，正庚烷，正辛烷)的t R值可分別設定為t(n-i)tM、tntM、t(ni)tM，把它們代入(312)式；則得：C(ni)= mlog (t(n-i)tM )+q (53)Cn=mlog(tntM )+q (54)C(n+i)= mlog (t(n+i)tM )+q (55) 將(314)式減去(313)式，(315)式減去(314)式得:CnC(ni)= mlog (tntM )/(t(n-i)tM ) (56) C(n+i)Cn =

13、mlog (t(ni)tM )/(tntM ) (57)又因為存在(311)式的關系，所以得： (tntM )/(t(n-i)tM ) =(t(ni)tM )/(tntM) (58)整理(zhngl)(318)式，得到最終(zu zhn)結果： tM（t(ni)+t(n-i)-2tn）/ (t(ni)+t(n-i)2tn) (59) 式中i=1，2，3.； tn-i 第一個同系物的保留(boli)時間(正己烷)， tn 第二個同系物的保留時間(正庚烷)， tn+i第三個同系物的保留時間(正辛烷)。X. Guardino等人的驗證認為(59)式準確可靠，并提出i值愈大則計算出來的tM值愈準確。請

14、同學們根據本實驗測得的tn-i 、tn 、tn+i值，試計算出tM與甲烷組分實測值的比較值，分析其誤差。八、注意事項1色譜基本參數的測定，要嚴格控制操作條件的穩定性, 否則易產生誤差。2為了保護色譜柱，要求載氣首先打開，然后開機，結束時先關機，后關載氣；嚴格按照要求的順序開啟和關閉色譜儀。九、思考題1色譜基本參數測量與計算的關鍵問題是什么?2K值及Wh/2值的大小與色譜柱過程的哪些因素有關?其原因何在?控制哪些操作條件可以得到適宜K值和Wh/2值?實驗2 GC-MS用于 中揮發性成分的分析實驗目的了解氣相色譜-質譜聯用技術的基本原理；學習氣相色譜-質譜聯用技術定性鑒定的方法；了解色譜工作站的基

15、本功能；學會質譜定性和總體積積分面積歸一化法定量方法。二、實驗原理質譜法是一種重要的定性鑒定和結構分析方法，但沒有分離能力，不能直接分析混合物。色譜法則相反，它是一種有效的分離分析方法，特別適合于復雜混合物的分離，但對組分的定性鑒定有一定難度。如果把這兩種方法結合起來，將色譜儀作為質譜儀的進樣和分離系統，即混合試樣進入色譜柱分離，得到的單個組分按保留時間的大小依次進入質譜儀測定質譜，這樣就可以實現優勢互補，解決復雜混合物的快速分離和定性鑒定。氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）于1957年首次實現，并很快成為一種重要的分析手段廣泛應用于化工、石油、食品、藥物、法醫鑒定及環境監測等領域。氣相色譜-質

16、譜聯用的主要困難是兩者的工作氣壓不匹配(ppi)。質譜儀器必須在10-310-4Pa的高真空條件下工作，而氣相色譜儀的流出物為常壓（約100kPa），因此需要一個硬件接口來協調兩者的工作條件。當氣相色譜儀使用毛細管柱時，因為(yn wi)每分鐘幾毫升的流量不足以破壞質譜儀的真空狀態，所以可直接與質譜儀聯用。揮發性混合物從氣相色譜(s p)儀進樣，經色譜柱分離后，按組分的保留時間大小依次以純物質形式進入質譜儀，質譜儀自動重復掃描，計算機記錄和儲存所有的質譜信息，然后將處理結果顯示在屏幕上。質譜儀的每一次掃描都得到一張質譜圖，色譜組分流入時得到的是組分的質譜圖，沒有色譜組分時得到的是背景的質譜圖，

17、計算機將質譜儀重復掃描得到的所有離子流信號（不分質荷比大小）的強度總和對掃描信號（即色譜保留時間）作圖得到總離子流圖，總離子流強度的變化正是流入質譜儀的色譜組分變化的反映，所以在GC-MS中，總離子流圖相當于色譜圖，每一個譜峰代表了一個組分，譜峰的強度與組分的相對含量有關。三、儀器與試劑儀器: 島津公司GCMS-QP5050A氣相色譜-質譜聯用儀，GCMS Solution工作站，NIST譜庫。微量注射器（1L）DB-5毛細管色譜柱試劑：待分析揮發性混合物 正己烷為溶劑，均為色譜純。四、實驗步驟1. 氣相色譜條件優化島津2010氣進樣口以及檢測器溫度為250，分別采用等溫和程序升溫進行分析，并

18、根據樣品出峰情況確相色譜儀，氫火焰離子化檢測器，30 m0.25mmI.D. OV-1彈性石英毛細管柱，載氣N2，定優化的程序升溫條件。實驗條件包括：柱溫程序升溫條件、分流比、流速、進樣量。實驗所采用的條件為：起始溫度60，保持4分鐘，以10/min 升至250，維持10min； 分流進樣比為1：10；流速為1.0mLmin-1；進樣量為1L。獲得最佳條件后，對所提取的12個樣本進行測定，得到其色譜圖。2. 氣相色譜-質譜分析采用GC-MS以對樣品進行定性分析。將島津2010型氣相色譜與島津2010型質譜相連接來對揮發性成份進行定性分析。質譜條件(tiojin)：EI源電子轟擊(hngj)能量

19、70 eV；離子源溫度(wnd)200 ；倍增電壓0.9 kV； 掃描范圍40-400 amu；掃描速度0.2 s/scan。3. 定性定量分析在離線工作站利用質譜數據庫NIST147譜庫等對部分組分進行定性分析；采用歸一化法對樣品做定量分析。數據處理及譜圖解析1. 雙擊GCMS Postrun Analysis 圖標，出現與實時分析相似的圖面。直接點擊Open Data File，雙擊要選擇的數據文件名稱，右側出現相應的Tic(總離子色譜圖)。 2.顯示組分的質譜圖 在總離子流圖中組分峰1，放大Tic并扣本底，屏幕顯示扣除背景后的質譜圖。3.標準質譜圖譜庫的計算機檢索。4.打印組分的譜圖和標

20、準譜庫檢索結果。5.依次選擇其他組分峰，重復步驟2 4。6.將分析結果歸納匯總后填入下表：序號保留時間相對分子質量m/z化合物名稱分子式123（3）歸一化法可以用面積歸一，也可以對高度進行歸一化處理。而且一般不能直接對面積或高度歸一化，還需要乘上一個校正因子。實驗給出的結果，在不考慮校正因子時，對面積和高度歸一化處理得到的結果相差較大，因此還需要查找相關校正因子，才可以得到更為正確的結果。限于條件，這里給出面積歸一化法的數據處理處理結果。 結果與討論1. 實驗得到的色譜圖出現了16個峰，這說明樣品混合物中只有16中組分嗎？答：不一定。有些性質非常相近的物質，如手性化合物，在本實驗條件下不能夠有

21、效的分離，從而有相差無幾的保留時間，所以看到的每個峰都可能是多個化合物的峰疊加在一起形成的。2. 歸一化法有哪些優點和限制(xinzh)條件？答：歸一化法有下列(xili)有點和內標法一樣當色譜條件變動時對結果的影響不大，但比內標法方便(fngbin)一些。當分析同系物時，可粗略地認為它們的校正因子是一樣的，可把峰面積直接歸一化處理。歸一法定量有如下限制樣品有某些組分不能出現色譜峰時不能使用，即必須所有物質都流出色譜柱，在檢測器上要有信號。樣品中有些組分在色譜系統中有部分分解時不能使用。實驗3 GC-MS與保留指數聯合定性分析未知樣品一、目的要求1. 學習氣相色譜-質譜聯用技術定性鑒定的方法；

22、2. 學習保留指數測定方法3. 進一步熟悉GC-MS儀器原理及操作二、測定原理質譜分析法是通過對被測樣品離子的質荷比的測定來進行分析的一種分析方法。氣質聯用的有效結合既充分利用色譜的分離能力，又發揮了質譜的定性專長，優勢互補，結合譜庫檢索，可以得到較滿意的分離機鑒定結果。但對一些異構體， 物質的質譜信息可能會相同， 單用質譜定性有可能帶來不正確的結果，保留指數（retention index）又稱科瓦茨指數(Kovats index)， HYPERLINK /view/25162.htm t _blank 氣相色譜定性指標的一種參數。將質譜與保留指數聯合定性， 則將大大提高色譜定性結果的準確性。 將 HYPERLINK /view/1789744.htm t _blank 正構烷烴