1、生物化學與分子生物學1第十四章DNA的生物合成DNA Biosynthesis ( Replication )2復制(replication) 是以DNA為模板的DNA合成，是基因組的復制過程。在這個過程中，親代DNA作為合成模板，按照堿基配對原則合成子代分子，其化學本質是酶促脫氧核苷酸聚合反應。 復制親代DNA子代DNA3本章主要內容： DNA復制的基本特征 DNA復制的酶學和拓撲學變化 原核生物DNA復制過程真核生物DNA生物合成過程 逆轉錄和其他復制方式 4DNA復制的基本特征Basic Rules of DNA Replication第 一 節5半保留復制(semi-conservat

2、ive replication)雙向復制(bidirectional replication)半不連續復制(semi-discontinuous replication) DNA復制的主要特征 6一、 DNA以半保留方式進行復制 DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制。半保留復制的概念:7子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式: 全保留式 半保留式 混合式 8密度梯度實驗: 實驗

3、結果支持半保留復制的設想。含15N-DNA的細菌培養于普通培養液 第一代繼續培養于普通培養液 第二代梯度離心結果9按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現了遺傳的保守性。半保留復制的意義:遺傳的保守性，是物種穩定性的分子基礎，但不是絕對的。10AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復制過程中形成的復制

4、叉子代DNA11原核生物基因組是環狀DNA，只有一個復制起點（origin）。復制從起點開始，向兩個方向進行解鏈，進行的是單點起始雙向復制。二、DNA復制從起點向兩個方向延伸復制中的放射自顯影圖象12A. 環狀雙鏈DNA及復制起始點B. 復制中的兩個復制叉C. 復制接近終止點(termination, ter)oriterA B C13真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復制子(replicon) 。復制子是獨立完成復制的功能單位。 53oriorioriori531453oriorioriori535533553復制315三、DNA復制反

5、應呈半不連續特征3535解鏈方向35335領頭鏈(leading strand)后隨鏈(lagging strand)16順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續進行的，這股鏈稱為領頭鏈(leading strand) 。另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續延長，這股不連續復制的鏈稱為后隨鏈(lagging strand) 。復制中的不連續片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 領頭鏈連續復制而隨從鏈不連續復制，就是復制的半不連續性。 17DNA復制的酶學和拓撲學變化第 二 節The Enzymology and Topology of DNA Replicat

6、ion18參與DNA復制的物質:底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP；聚合酶(polymerase): 依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為 DNA-pol；模板(template): 解開成單鏈的DNA母鏈；引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質因子。19(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPiRNA引物RNA引物子代DNA20聚合反應的特點:DNA 新鏈生成需RNA引物和模板； 新鏈的延長只可沿5 3方向進行。21一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合全稱：依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-d

7、ependent DNA polymerase)簡稱：DNA-pol活性：1. 53 的聚合活性2. 核酸外切酶活性225 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 53 5外切酶活性:5 3外切酶活性:?能切除突變的 DNA片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。核酸外切酶活性: 23（一）原核生物有3種DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 24原核生物的DNA聚合酶25個核心酶1個-復合物（、 6種亞基）1對-亞基（可滑動的DNA夾子）DNA聚合酶全酶

8、結構全酶結構包括：26亞基（130 000）主要功能是合成DNA亞基具有35外切酶活性（復制保真性所必需）亞基可增強其活性亞基可能起組裝作用核心酶由、和亞基組成：兩側的亞基發揮夾穩DNA模板鏈，并使酶沿模板滑動的作用272個-亞基分別和1個核心酶相互作用，其柔性連接區可以確保在復制叉1個全酶分子的2個核心酶能夠相對獨立運動，分別負責合成前導鏈和后隨鏈。功能：有促進全酶組裝至模板上及增強核心酶活性的作用 -復合物由6種亞基組成：、28功能：DNA-pol （109kD）對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現的空隙進行填補。29323個氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段

9、604個氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。 30DNA-pol （120kD）DNA-pol II基因發生突變，細菌依然能存活。DNA-pol 對模板的特異性不高，即使在已發生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認為，它參與DNA損傷的應急狀態修復。31（二）常見的真核細胞DNA聚合酶有5種DNA-pol 起始引發，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復制 。在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。在線粒體DNA復制中起催化作用。DNA-po

10、l DNA-pol DNA-pol DNA-pol 32真核生物和原核生物DNA聚合酶的比較 E.Coli真核細胞 功能填補復制中的DNA空隙，DNA修復和重組復制中的校對，DNA修復DNA修復線粒體DNA合成前導鏈合成DnaG引物酶后隨鏈合成33真核生物的DNA聚合酶34二、DNA聚合酶的堿基選擇和校對功能實現復制的保真性復制按照堿基配對規律進行，是遺傳信息能準確傳代的基本原理。此外還需酶學的機制來保證復制的保真性。35遵守嚴格的堿基配對規律；聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能；復制出錯時有即時校對功能。DNA復制的保真性至少要依賴三種機制：36（一）復制的保真性依賴正確的堿基選擇利用“錯配

11、”實驗發現，DNA pol 對核苷酸的參入（incorporation）具有選擇功能。 DNA pol 對嘌呤的不同構型表現不同親和力，因此實現其選擇功能。 37（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在復制中辨認切除錯配堿基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來的酶，外切酶是有方向性的。 38A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確， DNA-pol不表現活性。DNA pol 的校讀功能39三、復制中的解鏈伴有DNA 分子拓撲學變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用

12、。 40（一）多種酶參與DNA解鏈和穩定單鏈狀態41E. Coli 基因圖42解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。引物酶(primase) 復制起始時催化生成RNA引物的酶。單鏈DNA結合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復制中維持模板處于單鏈狀態并保護單鏈的完整。 43108局部解鏈后（二）DNA拓撲異構酶改變DNA超螺旋狀態復制過程正超螺旋的形成：44解鏈過程中正超螺旋的形成45既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵。 拓撲異構酶 拓撲異構酶拓撲異構酶分類：拓撲異構酶作用特點：46拓撲異構酶

13、切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口，DNA變為松弛狀態。反應不需ATP。拓撲異構酶切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端， DNA分子進入負超螺旋狀態。作用機制：47拓撲酶的作用方式：48四、DNA連接酶連接復制中產生的單鏈缺口連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。 DNA連接酶(DNA ligase)作用方式：49HO5335DNA連接酶ATPADP5353DNA連接酶的作用：50DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接

14、中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：51提供核糖3-OH提供5-P結果DNA聚合酶引物或延長中的新鏈游離dNTP去PPi(dNTP)n+1連接酶復制中不連續的兩條單鏈不連續連續鏈拓撲酶切斷、整理后的兩鏈改變拓撲狀態DNA聚合酶，拓撲酶和連接酶催化3,5-磷酸二酯鍵生成的比較 52原核生物DNA復制過程The Process of DNA Replication in Prokaryotes第 三 節53起始是復制中較為復雜的環節，在此過程中，各種酶和蛋白因子在復制起始點處裝配引發體，形成復制叉并合成RNA引物。 需要解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。2. 形成

15、引發體，合成引物，提供3-OH末端。一、復制的起始54E.coli復制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串聯重復序列 反向重復序列5353（一） DNA的解鏈55原核生物的復制起始部位及解鏈 56 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓撲異構酶引物酶SSB3535（二）引物合成和引發體形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區域的復合結構稱

16、為引發體。573535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物3 HO5引物酶58引發體和復制叉的生成 5960二、DNA鏈的延長復制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。 61 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-pol62領頭鏈的合成：領頭鏈的子鏈沿著53方向可以連續地延長。63后隨鏈的合成64 在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈65復制過程簡圖66原核生物基因是環狀DNA，雙向復制的復制片段在復制的終止點(ter)處匯合。oriter E.coli823

17、2 ori terSV40500三、復制的終止67555RNA酶OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP+Pi55DNA連接酶 子鏈中的RNA引物被取代6869真核生物DNA生物合成過程The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes第 四 節70真核生物復制子多、岡崎片段短、復制叉前進速度慢等；DNA復制從引發進入延伸階段發生DNA聚合酶/轉換；切除岡崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等。 真核生物與原核生物DNA復制的差異：71哺乳動物的細胞周期DNA合成期G1G2SM細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關鍵點。G1

18、S及G2M的調節，與蛋白激酶活性有關。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調控作用。 72真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不是同步起動。 復制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復制因子(replication factor, RF)。 一、真核生物復制的起始與原核基本相似73酵母復制起點為自主復制序列（autonomously replicating sequences，ARS）： 酵母染色體含有多個復制起點。元件A(富含A/T的共有序列)：結合一個特異的蛋白質復合物復制起點識別

19、復合物(ORC)。 3個序列(B1、B2和B3)可以增加復制起點的效率，其中B2的9個堿基與上述ARS共有序列相同。酵母復制起始點74增殖細胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在復制起始和延長中起關鍵作用。PCNA為同源三聚體，具有與E.coli DNA 聚合酶的亞基相同的功能和相似的構象，即形成閉合環形的可滑動DNA夾子，在RFC的作用下PCNA結合于引物模板鏈；并且PCNA使pol獲得持續合成能力。PCNA水平也是檢驗細胞增殖的重要指標。75拓撲異構酶，去除負超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復制叉前方產生的正超螺旋Tol和TolDNA雙

20、螺旋解鏈，參與組裝引發體DNA解旋酶連接岡崎片段DNA連接酶核酸酶，切除RNA引物RNAse H核酸酶，切除RNA引物FEN1DNA復制，核苷酸切除修復，堿基切除修復Pol /合成RNA-DNA引物Pol /引發酶有依賴DNA的ATPase活性，結合于引物-模板鏈，激活DNA聚合酶， 促使PCNA結合于引物-模板鏈RFC激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性PCNA單鏈DNA結合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易結合DNARPA功 能蛋白質真核DNA復制叉主要蛋白質的功能76DNA-pol 和pol 分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。在復制叉及引物生成后，DNA-pol 通過PCNA的協同作

21、用，逐步取代pol ，在RNA引物的3-OH基礎上連續合成領頭鏈。隨從鏈引物也由pol 催化合成。然后由PCNA協同，pol 置換pol ，繼續合成DNA子鏈。 二、真核生物復制的延長發生DNA聚合酶/轉換77前導鏈：出現在引發后期后隨鏈：發生于每個岡崎片段合成之際發生DNA聚合酶/轉換的原因是Pol 不具備持續合成能力。DNA聚合酶/轉換的關鍵蛋白是RFC。DNA聚合酶/轉換78真核DNA聚合酶轉換和后隨鏈合成793553領頭鏈3535親代DNA后隨鏈引物核小體三、真核生物DNA合成后立即組裝成核小體80染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接。染色體兩端D

22、NA子鏈上最后復制的RNA引物，去除后留下空隙。四、端粒酶參與解決染色體末端復制問題81切除引物的兩種機制82前導鏈產生完整的子染色單體。后隨鏈3端留下縮短的未復制的ssDNA區。8353355335+533335584端粒（telomeres）由富含TG的重復序列組成。人的端粒重復序列為5-(TnGn)x-3。這些重復序列多為雙鏈，但每個染色體的3端比5端長，形成單鏈ssDNA。這一特殊結構可解決染色體末端復制問題。85端粒酶(telomerase)端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶協同蛋白(human telomerase associated pr

23、otein 1, hTP1)端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 組成：86端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白質組成。端粒酶以自己的RNA組分作為模板，以染色體的3端ssDNA（后隨鏈模板）為引物，將端粒序列添加于染色體的3端。這些新合成的DNA為單鏈。87端粒酶催化作用的爬行模型 88真核所有染色體DNA復制僅僅出現在細胞周期的S期，而且只能復制一次。五、真核生物染色體DNA在每個細胞周期中只能復制一次89前復制復合物在G1期形成而在S期被激活真核細胞DNA復制的起始分兩步進行，即復制

24、基因的選擇和復制起點的激活。復制基因（replicator）是指DNA復制起始所必需的全部DNA序列。90復制基因的選擇出現于G1期，基因組的每個復制基因位點均組裝前復制復合物（pre-replicative complex，pre-RC）。復制起點的激活出現于細胞進入S期以后，這一階段將激活pre-RC，募集若干復制基因結合蛋白和DNA聚合酶，并起始DNA解旋。在原核細胞中，復制基因的識別與DNA解旋、募集DNA聚合酶偶聯進行。而在真核細胞中，這兩個階段相分離可以確保每個染色體在每個細胞周期中僅復制一次。91ORC至少募集兩種解旋酶加載蛋白Cdc6和Cdt1。復制起點識別復合物（origin

25、recognition complex，ORC）識別并結合復制基因。三種蛋白質一起募集真核細胞解旋酶Mcm2-7。前復制復合物（pre-RC）的形成92pre-RC磷酸化導致在復制起點組裝其它復制因子并起始復制，復制因子包括3種DNA聚合酶。DNA聚合酶在復制起點按一定順序組裝：首先Pol 和Pol 結合，然后是Pol /引發酶。在S期，pre-RC被蛋白激酶（Ddk和Cdk）磷酸化，從而被激活。93pre-RC的激活和組裝真核DNA復制叉94（1）激活pre-RC，以起始DNA復制；（2）抑制形成新的pre-RC。CDK控制pre-RC的形成和激活真核細胞通過依賴細胞周期蛋白的蛋白激酶（cy

26、clin-dependent kinases，CDK）嚴格控制pre-RC的形成和激活。Cdk功能：95在每個細胞周期過程中，僅有一次機會形成pre-RC，也僅有一次機會激活pre-RC。pre-RC在被激活后即解體，所暴露的復制基因可形成新的pre-RC并迅速結合ORC。但在S、G2和M期，高活性的Cdk抑制pre-RC的其它組分結合ORC。只有當染色體分離和細胞分裂完成時，Cdk的活性消失，新的pre-RC才能形成。96逆轉錄和其他復制方式Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways第五節97雙鏈DNA是大多數生物的遺傳物質。某些病毒的遺傳物質是RNA。原核生物的質粒，真核生物的線粒體DNA，都是染色體外存在的DNA。這些非染色體基因組，采用特殊的方式