1、會(huì)計(jì)學(xué)1新型十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物殺蟲(chóng)活性及新型十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物殺蟲(chóng)活性及機(jī)理開(kāi)題報(bào)告機(jī)理開(kāi)題報(bào)告1.1.選題依據(jù)及意義選題依據(jù)及意義 浙江省是全國(guó)重點(diǎn)產(chǎn)竹省份，竹林面積約占全國(guó)的六分之一。全省竹林面積為 81.93 萬(wàn) hm2，占森林面積的13.8%。國(guó)家林業(yè)局統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示， 2012年，中國(guó)竹業(yè)總產(chǎn)值達(dá)195億美元，從業(yè)人員達(dá)到775萬(wàn)人 。2011年，浙江省竹產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值實(shí)現(xiàn)300億元，近40個(gè)縣（市、區(qū)）的竹業(yè)產(chǎn)值超過(guò)億元。 浙江省竹產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品品種豐富，應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，涉及建筑、家具、造紙、 包裝、運(yùn)輸、食品、 醫(yī)藥、保健、紡織、旅游、環(huán)保等行業(yè)，成為從資源培育到加工利用和出口貿(mào)易的新

2、興朝陽(yáng)行業(yè)。第1頁(yè)/共22頁(yè)1.1.選題依據(jù)及意義選題依據(jù)及意義 竹林的經(jīng)營(yíng)培育已告別傳統(tǒng)方式， 向規(guī)模化、 集約化、 現(xiàn)代化方向發(fā)展。 目前中國(guó)竹產(chǎn)業(yè)存在的問(wèn)題主要在產(chǎn)量向產(chǎn)值的轉(zhuǎn)換和病蟲(chóng)害防治方面，傅懋毅說(shuō)。當(dāng)下竹產(chǎn)業(yè)要突破的一個(gè)方向，是在保證生態(tài)保護(hù)的前提下實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)竹類(lèi)作物推廣。當(dāng)前全國(guó)范圍內(nèi)，高產(chǎn)竹只占種植面積的10。氣候因素？純林潛在威脅。 第2頁(yè)/共22頁(yè)竹農(nóng)為了生產(chǎn)效益， 廣泛使用高度農(nóng)藥，如敵敵畏，毒死蜱等，造成高殘留的同時(shí)，殺死害蟲(chóng)天敵，造成生態(tài)環(huán)境的破壞。尚未有正式林藥登記。1.1.選題依據(jù)及意義選題依據(jù)及意義 第3頁(yè)/共22頁(yè)防治難題：防治難題：1）缺乏安全有效防治方法，

3、又不敢使用農(nóng)藥，造成嚴(yán)重減產(chǎn)；2）亂用藥，造成農(nóng)藥殘留，危害食品安全，嚴(yán)重影響價(jià)格、出口和生產(chǎn)前景，對(duì)產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展形成了嚴(yán)重威脅。3）天維菌素保留了十六元內(nèi)酯環(huán)的主體結(jié)構(gòu)和C13位二糖基，其螺縮酮基團(tuán)和米爾貝霉素相同。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道，是一種新的十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物。 對(duì)鱗翅目、鞘翅目幼蟲(chóng)、線蟲(chóng)、螨蟲(chóng)具有較好的生物活性。1.1.選題依據(jù)及意義選題依據(jù)及意義 第4頁(yè)/共22頁(yè)o 本論文將在十六元環(huán)內(nèi)酯化合物5、13位等碳原子上，應(yīng)用化學(xué)合成、生物合成等手段，構(gòu)建結(jié)構(gòu)新穎、多樣的十六元環(huán)內(nèi)酯衍生物，以供試生物為供試生物，系統(tǒng)測(cè)定各化合物的殺蟲(chóng)活性；克隆供試生物的谷氨酸配體門(mén)控氯離子通道（Gl

4、uCl）基因，將其轉(zhuǎn)入COS-7細(xì)胞，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究十六元環(huán)內(nèi)酯衍生物對(duì)供試生物GluCl的激活能力（IC50）。以化合物的結(jié)構(gòu)參數(shù)、殺螨活性LC50及LC90值，以及與GluCl親和力IC50值，建立QSAR模型，解析十六元環(huán)內(nèi)酯衍生物殺蟲(chóng)活性的分子機(jī)制，并建立以谷氨酸配體門(mén)控氯離子通道（GLuCl）為靶標(biāo)的化合物高通量篩選平臺(tái)。項(xiàng)目將為新一代大環(huán)內(nèi)酯殺蟲(chóng)殺螨劑開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。論文設(shè)計(jì)思路論文設(shè)計(jì)思路第5頁(yè)/共22頁(yè)o（1）在十六元環(huán)內(nèi)酯化合物5、13位碳原子上，應(yīng)用化學(xué)合成、生物合成等手段，構(gòu)建結(jié)構(gòu)新穎、多樣的衍生物6080個(gè)。以竹螟等為供試生物，系統(tǒng)測(cè)定各化合物的

5、殺蟲(chóng)活性，得到各化合物對(duì)供試生物的LC50及LC90。o（2）克隆供試生物的谷氨酸配體門(mén)控氯離子通道（GluCl）基因，將其轉(zhuǎn)入COS-7細(xì)胞，構(gòu)建起轉(zhuǎn)GluCl基因的細(xì)胞株。o（3）采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，測(cè)定十六元環(huán)內(nèi)酯化合物對(duì)供試生物GLuCl的激活能力（IC50），構(gòu)建以谷氨酸配體門(mén)控氯離子通道（GLuCl）為靶標(biāo)的化合物高通量篩選平臺(tái)，建立起以化合物與受體作用的定量參數(shù)指導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)改造的技術(shù)體系。o（4）以化合物的結(jié)構(gòu)參數(shù)、殺蟲(chóng)活性LC50及LC90值和與GluCl親和力IC50值，建立QSAR模型；從化合物結(jié)構(gòu)與GluCl特征解析十六元環(huán)內(nèi)酯化合物殺蟲(chóng)活性的分子機(jī)制。得到以十六元環(huán)

6、內(nèi)酯化合物為基礎(chǔ)的新農(nóng)藥分子模板。2.2.研究目標(biāo)及內(nèi)容研究目標(biāo)及內(nèi)容第6頁(yè)/共22頁(yè)o本論文研究?jī)?nèi)容1）十六元環(huán)內(nèi)酯化合物的衍生合成2）十六元環(huán)內(nèi)酯化合物對(duì)供試生物活性測(cè)定3）供試生物GLuCl基因克隆4）GLuCl基因cDNA真核表達(dá)載體pcDNA3.1的構(gòu)建5）轉(zhuǎn)GLuCl基因COS-7細(xì)胞株的建立及檢測(cè)6）全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)定十六元環(huán)內(nèi)酯化合物與GLuCl蛋白親和力測(cè)定7）建立基于殺蟲(chóng)活性及與GLuCl蛋白親和力的天維菌素衍生物的QSAR模型2.2.研究目標(biāo)及內(nèi)容研究目標(biāo)及內(nèi)容第7頁(yè)/共22頁(yè)o3.1十六元環(huán)內(nèi)酯化合物的設(shè)計(jì)十六元環(huán)內(nèi)酯化合物的設(shè)計(jì)o系列（系列（1）應(yīng)用生物電子等排的分

7、子設(shè)計(jì)思路，在糖基的4-位引入甲氧基、氟、氯，氨基、巰基、三氟甲基等簡(jiǎn)單官能團(tuán)，考察其取代基電性、取代基數(shù)目、取代位置的變化對(duì)殺蟲(chóng)活性的影響；初步設(shè)計(jì)20個(gè)化合物；3.3.研究方法及試驗(yàn)方案研究方法及試驗(yàn)方案（ 4位）位）R1 = NH2, OCH3, H, NO2,F,Cl,CF3,SH等 取代基OOCH3OOOHCH3OHOHHHH3COHOOCH3H3COOOCH3H3CHORR=CH3或 C2H5OOCH3OOOHCH3OHOHHHH3COHOOCH3H3COOOCH3H3CR1RR=CH3或 C2H5第8頁(yè)/共22頁(yè)o系列（系列（2、3）天維菌素的4位的異腈構(gòu)建或13-位的異腈構(gòu)建

8、3.3.研究方法及試驗(yàn)方案研究方法及試驗(yàn)方案OOCH3OOOHCH3OHOHHHH3CHOHROOCH3OOOHCH3OHOHHHH3CHROOCH3OOOHCH3OHOHHHH3COHCHNHROOCH3OOOHCH3OHOHHHH3CCNHR基于異腈參與的多組分反應(yīng)多樣性導(dǎo)向合成（ 4位）位）13-位位Chemical Papers, 2011, 65 (5), 739742 Tetrahedron Letters, 2009, 50, 19821985Organic Preparations and Procedures International Volume, 2003, 35, 4

9、第9頁(yè)/共22頁(yè)o系列（系列（2、3）基于異腈參與的多組分反應(yīng)多樣性導(dǎo)向合成天維菌素衍生物；初步設(shè)計(jì)30個(gè)化合物；3.3.研究方法及試驗(yàn)方案研究方法及試驗(yàn)方案胺源變化的胺源變化的Ugi and Passerini 反應(yīng)：反應(yīng)： 胺基組分的變化：哌嗪、哌啶、一級(jí)胺、二級(jí)胺、羥胺（肟）、肼（腙）、磺酰胺、氨基酸。 第10頁(yè)/共22頁(yè)o系列（系列（4）o 4-位引入醚、酯、酰胺、脒、脲、硫脲、磺酰基、磷酰基等活性單元，構(gòu)建結(jié)構(gòu)多樣的天維菌素分子，以期在保留原有先導(dǎo)活性的基礎(chǔ)上，降低其毒性，增加其滲透性和生物體內(nèi)的傳導(dǎo)或改變其活性譜和提高其選擇性和理化性能。初步設(shè)計(jì)20個(gè)化合物；3.3.研究方法及試驗(yàn)

10、方案研究方法及試驗(yàn)方案OOOCH3H3COOOCH3H3CHNHNROOOOOCH3H3COOOCH3H3CHOOOOCH3H3COOOCH3H3CHNHNRSOOOCH3H3COOOCH3H3CHNSROONHR1NR2R3nOOOCH3H3COOOCH3H3CHNOOOCH3H3COOOCH3H3CHNPR1XR2OOOCH3H3COOOCH3H3CXRX=NH,O,S第11頁(yè)/共22頁(yè)o3.2十六元環(huán)內(nèi)酯化合物殺蟲(chóng)活性測(cè)定十六元環(huán)內(nèi)酯化合物殺蟲(chóng)活性測(cè)定 供試?yán)ハx(chóng)供試?yán)ハx(chóng)：選取竹螟、竹金針蟲(chóng)、竹筍夜蛾幼蟲(chóng)等試蟲(chóng)為供試?yán)ハx(chóng)。 供試藥劑供試藥劑：合成的十六元環(huán)內(nèi)酯系列化合物 活性測(cè)定方法活性測(cè)

11、定方法：采用葉碟法等測(cè)定供試化合物對(duì)試蟲(chóng)的毒殺活性。3.3.研究方法及試驗(yàn)方案研究方法及試驗(yàn)方案o3.3十六元環(huán)內(nèi)酯化合物殺蟲(chóng)殺蟲(chóng)構(gòu)效關(guān)系分析與研究十六元環(huán)內(nèi)酯化合物殺蟲(chóng)殺蟲(chóng)構(gòu)效關(guān)系分析與研究 o定量構(gòu)效關(guān)系（定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）：）：以合成的衍生物的殺蟲(chóng)活性為依據(jù)，結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)上的變化，首先用Hyperchem軟件中的MM+分子力學(xué)方法對(duì)分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，然后用Mopac軟件中的半經(jīng)驗(yàn)量子化學(xué)方法AM1對(duì)分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。將計(jì)算結(jié)果輸入到CODESSA程序，計(jì)算化合物的各種結(jié)構(gòu)參數(shù)，然后用啟發(fā)式回歸方法建立這些化合物的結(jié)構(gòu)與其生物活性之間的定量函數(shù)關(guān)系，解釋分子的結(jié)構(gòu)與活性

12、之間的定量關(guān)系。并推測(cè)理想的高活性化合物的模型，指導(dǎo)新分子的設(shè)計(jì)合成。第12頁(yè)/共22頁(yè)3.3.研究方法及試驗(yàn)方案研究方法及試驗(yàn)方案o3.4十六元環(huán)內(nèi)酯十六元環(huán)內(nèi)酯高活性化合物的毒力、作用方式及作用高活性化合物的毒力、作用方式及作用機(jī)理的進(jìn)一步系統(tǒng)測(cè)定機(jī)理的進(jìn)一步系統(tǒng)測(cè)定o以建立的QSAR模型為依據(jù)，選取4-5個(gè)高活性化合物，通過(guò)觀察其對(duì)多種試蟲(chóng)表現(xiàn)出來(lái)的活性高低，確定該類(lèi)化合物的毒力、殺蟲(chóng)譜，同時(shí)，對(duì)不同的試蟲(chóng)采用適當(dāng)?shù)慕o藥途徑和活性試測(cè)方法，進(jìn)一步明確高活性化合物對(duì)試蟲(chóng)的作用方式。第13頁(yè)/共22頁(yè)3.3.研究方法及試驗(yàn)方案研究方法及試驗(yàn)方案o以GLuCl為靶標(biāo)的殺蟲(chóng)機(jī)理研究 根據(jù)其他生物

13、的GLuCl基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，提取供試生物RNA，擴(kuò)增供試生物GLuCl基因的中間部分序列，采用5-RACE和3-RACE策略，擴(kuò)增供試生物GLuCl基因的5末端和3末端，拼接獲得供試生物GLuCl基因cDNA全長(zhǎng)，根據(jù)cDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)引物，以供試生物RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增獲得供試生物GLuCI基因的cDNA。將GLuCl基因cDNA插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將此重組表達(dá)載體導(dǎo)入COS-7細(xì)胞，SDS-PAGE檢測(cè)驗(yàn)證GLuCl基因在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因COS-7細(xì)胞備用。化合物與供試生物化合物與供試生物GLuCl親和力測(cè)定方法親和力測(cè)定

14、方法o采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，測(cè)定天維菌素及其螺縮酮衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞GLuCl的IC50值，根據(jù)IC50值分析天維菌素及其螺縮酮上各種基團(tuán)衍生基團(tuán)對(duì)化合物與GLuCl蛋白的親和力的影響規(guī)律。第14頁(yè)/共22頁(yè)第15頁(yè)/共22頁(yè) （1）十六元環(huán)內(nèi)酯螺縮酮等基團(tuán)修飾是否是提高其殺蟲(chóng)活性的關(guān)鍵。 （2）十六元環(huán)內(nèi)酯螺縮酮等基團(tuán)不同碳原子上不同取代基的性質(zhì)對(duì)衍生物和GLuCl蛋白親和力的影響規(guī)律。 （3）建立以天維菌素為基礎(chǔ)的新農(nóng)藥分子模板，為十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)改造及鏈霉菌基因改造提供方向。3.3.研究方法及試驗(yàn)方案研究方法及試驗(yàn)方案o3.7 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題 第16頁(yè)

15、/共22頁(yè)4.4.預(yù)期進(jìn)展及成果預(yù)期進(jìn)展及成果 預(yù)期進(jìn)展：預(yù)期進(jìn)展：2014.7-2015.1：天維菌素衍生物合成，完成測(cè)定化合物活性，得到天維菌素衍生物60個(gè)以上；供試生物GLuCl基因克隆，獲得GLuCl基因cDNA全長(zhǎng)。2015.2-2015.6：完成天維菌素衍生物構(gòu)效關(guān)系研究；發(fā)表論文一篇；2015.7-2016.6：測(cè)定天維菌素及其衍生物對(duì)供試生物GLuCl的作用機(jī)理；完成制劑研制和大田應(yīng)用研究。預(yù)期成果：預(yù)期成果：發(fā)表文章24篇，其中SCI 2篇； 申請(qǐng)專(zhuān)利12項(xiàng)。第17頁(yè)/共22頁(yè)5.5.工作基礎(chǔ)工作基礎(chǔ)1. 產(chǎn)天維菌素工程菌的構(gòu)建產(chǎn)天維菌素工程菌的構(gòu)建 天維菌素是將對(duì)阿維菌素產(chǎn)生菌（除蟲(chóng)鏈霉菌，保藏登記號(hào)ATCC NO:31267）和米爾貝霉素產(chǎn)生菌（吸水鏈霉菌，保藏登記號(hào)CGMCC No.7677）相關(guān)基因進(jìn)行改造后，構(gòu)建的工程菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。 2.天維菌素的毒性測(cè)定天維菌素的毒性測(cè)定 采用化合物對(duì)大鼠急性毒性測(cè)定方法，初步測(cè)定了天維菌素對(duì)SD大鼠的毒性。在飼藥劑量為100mg/kg（體重）時(shí)，大鼠未出現(xiàn)死亡，大鼠僅表現(xiàn)出有體溫降低現(xiàn)象，無(wú)其他顯著變化。初步結(jié)論：天維菌素對(duì)大鼠的急性毒性LD50大于1