1、第8頁 共8頁2022核酸檢測基本知識核酸檢測報告樣本核酸檢測基本知識 1.什么是核酸檢測 核酸的定義：核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3，5-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。 核酸具有非常重要的生物功能，主要是貯存遺傳信息和傳遞遺傳信息。 2.核酸的分類 核酸大分子可分為兩類：脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 3.核酸的組成 DNA和RNA都是由一個一個核苷酸(nucleotide)頭尾相連而形成的，由C、H、O、N、P，5種元素組成。DNA是絕大多數生物的遺傳物質，RNA是少數不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遺傳物質。RNA平均長度大約為2000個

2、核苷酸，而人的DNA卻是很長的，約有3X109個核苷酸。 4.核酸的功能 在蛋白質的復制和合成中起著儲存和傳遞遺傳信息的作用。核酸不僅是基本的遺傳物質，而且在蛋白質的生物合成上也占重要位置，因而在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現象中起決定性的作用。 DNA與RNA都是核酸，它們在化學組成上有什么區別如下： DNA與RNA的比較 DNA RNA 主要存在部位 細胞核 細胞質 基本組成單位 脫氧核苷酸 核糖核苷酸 堿基種類 A、G、C、T A、G、C、U 五碳糖種類 脫氧核糖 核糖 核苷酸鏈 兩條脫氧核苷酸鏈 一條核糖核苷酸鏈 5.檢測方法 核酸檢測方法，主要通過同時進行靶核酸擴增和可檢測信號的

3、生成來檢測樣品中的靶核酸。可應用于臨床微生 物學、血液篩選、遺傳病診斷和預防、法醫學等領域的核酸檢測。 目前主要使用的方法有以下幾種： a.核酸序列依賴性擴增法 NASBA是由一對引物介導的、連續均一的、體外特異性核苷酸序列等溫擴增RNA的新技術。反應在42進行,可在2h內將RNA模板擴增約109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆轉錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物進行擴增。整個反應分非循環相和循環相:在非循環相中,引物I與模板RNA退火后在AMV逆轉錄酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA雜合體,隨即RNaseH降解RNA,引物與cDNA退火,在反轉錄酶作用下合成第2

4、條DNA互補鏈。雙鏈DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,經其啟動子序列起動而轉錄RNA，RNA又可在反轉錄酶的作用下反轉錄成DNA，進入循環相,對模板進行大量擴增。 b.轉錄介導的擴增技術 TMA技術原理與NASBA基本一致，略有不同之處是TMA利用的是MMLV逆轉錄酶及T7RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉錄酶既有逆轉錄酶的活性又具有RNA酶H活性。反應在41.5進行,可在1h內將RNA模板擴增約109倍。 c.連接酶酶促鏈式反應(LCR) LCR是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種 探針擴增技術，是繼PCR后新發展的一種較有前景的體外擴增技術。它的原理就是由2段寡核苷酸單鏈DNA探針

5、與目標序列雜交,當該2段DNA探針與沒有發生突變的模板褪火后,如果2探針是緊鄰的,中間沒有核苷酸間隔,則可在連接酶作用下連接起來,連接以后的新鏈又可以作為模板,引導下一周期的連接產生新的子鏈。若連接區段發生核苷酸的堿基突變,則連接反應不能發生,擴增反應終止。 d.多聚酶鏈反應檢測法(PCR) PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個基本反應步驟構成。 模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。 模板DN

6、A與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。 引物的延伸：DNA模板引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成1條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次 循環的模板。每完成1個循環需24min，23h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。檢測HIVRNA,需要先利用逆轉錄反應將RNA轉錄為cDNA，繼而以cDNA為模板進行PCR擴增即可，這樣的反應稱為RT-PCR。 e.實時熒光定

7、量PCR技術 實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析p 的方法。 本技術的原理是使用熒光基團標記探針,5端標記熒光基團R,3端標記淬滅基團Q,在沒有PCR擴增時,由于熒光基團和淬滅基團空間距離很近,使熒光基團被淬滅,不發熒光;而當PCR擴增時,引物與熒光標記的特異性探針同時結合在模板上,熒光標記的探針與模板的結合位置位于上下游引物之間,利用Taq酶的53外切酶活性,將熒光探針水解,熒光基團被釋放出來,由于在空間上與淬滅基團分開,則發出熒光。發出的熒光可以被熒光探頭檢測到,一邊擴增,一邊檢測,這樣就實

8、現了“實時”檢測。該技術不僅實現了PCR從半定量到定量的飛躍,而且與常規PCR相比,它具有特異性強、自動化程度高、有效解決了PCR污染問題等特點。 f.支鏈DNA檢測法bDNA bDNA是定量檢測血漿中的HIV1型RNA的一種方法。bDNA是指人工合成的帶有側鏈的DNA片段,在其每個側鏈上 都可以標記被激發的標記物。將HIV的RNA通過離心從病毒顆粒中釋放出來,然后用捕獲探針1將其捕獲到微孔中。捕獲探針2與病毒RNA的另一部分特異結合,又與預放大探針結合。后者再與放大探針即bDNA探針雜交。兩套靶探針分別與病毒RNA的pol基因的不同區域特異結合。在微孔中形成HIVRNA寡核苷酸復合物。再加入

9、1種化學發光底物孵育后可放大化學發光信號。通過發光強度來定量,因為發光強度與樣品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在擴增物的交叉污染,這較PCR是一大進步。bDNA有數十個覆蓋整個基因組的探針,可以方便地檢測HIV某些變異株,但靈敏度不及PCR，提高bDNA靈敏度是一大難點。 檢測步驟 HIV核酸定性檢測技術，其檢測過程分為核酸提取、逆轉錄合成cDNA、PCR擴增反應、擴增產物定性分和結果判定和完成報告單。 6.實驗室檢測具體步驟如下： a.核酸提取 使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設備并按說明書操作。提取RNA時應注意防止RNA降解。DNA應置于-20保存

10、，RNA和需長期保存的DNA應置于-80保存。 b.逆轉錄合成cDNA 逆轉錄cDNA合成反應需使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行逆轉錄反應。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進行第一輪擴增反應。逆轉錄cDNA合成反應需使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行逆轉錄反應。使用商品化RT-PCR一步法試劑進行第一輪擴增反應。 c.PCR擴增反應（使用二

11、次擴增的套式PCR擴增方法）PCR反應需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）。在擴增儀中，按照設定的程序進行擴增。使用二次擴增的套式PCR擴增方法。 e.擴增產物定性分析p 擴增產物常用分析p 方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標準比較，判斷擴增片段是否在預期的分子量范圍內。其它擴增產物分析p 方法還有限制性內切酶酶切分析p 、特異性探針雜交分析p 以及DNA序列分析p 等。自動化核酸擴增儀使用酶聯比色分析p 或熒光探針雜交等原理測定。 （1）實驗成立的條件：每一次檢測需同時做兩個陽性 對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預期的片段、陰性對照沒有擴增出任何片段、