1、新藥研發(fā)中藥物分析方法建立與驗證袁艷娟2015.04.172022-6-302F分析方法的設(shè)計依據(jù)分析方法的設(shè)計依據(jù)F分析方法建立的一般步驟分析方法建立的一般步驟F分析方法驗證的內(nèi)容與要求分析方法驗證的內(nèi)容與要求F藥物分析應(yīng)用示例藥物分析應(yīng)用示例內(nèi)容提要內(nèi)容提要2022-6-303第一節(jié)第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù)分析方法的設(shè)計依據(jù)建立分析檢測方法的主要依據(jù)建立分析檢測方法的主要依據(jù) 待測藥物的理化性質(zhì)及在生物體內(nèi)的存在狀況待測藥物的理化性質(zhì)及在生物體內(nèi)的存在狀況 分析測定的目的與要求分析測定的目的與要求 生物樣品的類型與預(yù)處理方法生物樣品的類型與預(yù)處理方法 實驗室條件實驗室條件2022-6-3

2、04一、一、待測藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況待測藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況準(zhǔn)確測定準(zhǔn)確測定生物樣品中的藥物或其特定代謝物生物樣品中的藥物或其特定代謝物預(yù)處理預(yù)處理待測物待測物從結(jié)合物或綴合物中從結(jié)合物或綴合物中釋放釋放選擇樣品選擇樣品預(yù)處理方法預(yù)處理方法首先應(yīng)考慮首先應(yīng)考慮待測藥物的待測藥物的理化性質(zhì)理化性質(zhì)藥物在生物體內(nèi)的藥物在生物體內(nèi)的存在狀況存在狀況藥物在生物體內(nèi)的藥物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化( (代謝代謝) )途徑途徑2022-6-305(一一)待測藥物的理化性質(zhì)待測藥物的理化性質(zhì)藥物的藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等預(yù)處理及檢測方法預(yù)處理

3、及檢測方法具有具有親脂性親脂性在適當(dāng)?shù)脑谶m當(dāng)?shù)膒H值下用值下用溶劑萃取溶劑萃取具有具有強極性或親水性強極性或親水性沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取衍生化后萃取等等具有具有揮發(fā)性揮發(fā)性GC測定法測定法具有具有光譜或電化學(xué)特性光譜或電化學(xué)特性分析檢測方法分析檢測方法藥物的藥物的穩(wěn)定性穩(wěn)定性萃取濃縮技術(shù)萃取濃縮技術(shù)對酸堿不穩(wěn)定對酸堿不穩(wěn)定避免使用強酸或強堿性溶劑避免使用強酸或強堿性溶劑對熱不穩(wěn)定對熱不穩(wěn)定避免高溫蒸發(fā)溶劑避免高溫蒸發(fā)溶劑2022-6-306( (二二) )待測藥物的體內(nèi)存在狀態(tài)待測藥物的體內(nèi)存在狀態(tài)與血漿蛋白結(jié)合的強弱及結(jié)合率的高低與血漿蛋

4、白結(jié)合的強弱及結(jié)合率的高低分離萃取方法分離萃取方法蛋白結(jié)合較強蛋白結(jié)合較強不宜直接采用溶劑萃取不宜直接采用溶劑萃取體內(nèi)濃度高低、代謝過程及其代謝產(chǎn)物體內(nèi)濃度高低、代謝過程及其代謝產(chǎn)物分析檢測技術(shù)分析檢測技術(shù)濃度較低濃度較低（尤其有（尤其有代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物共存）共存）代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時測定代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時測定采用采用LC-MS等分析檢測技術(shù)等分析檢測技術(shù) 2022-6-307二、分析測定的目的與要求二、分析測定的目的與要求藥代動力學(xué)藥代動力學(xué)研究藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程研究藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代謝產(chǎn)

5、物血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代謝產(chǎn)物要求要求同時測定原形藥物和代謝產(chǎn)物同時測定原形藥物和代謝產(chǎn)物檢測檢測寬線性范圍寬線性范圍(CmaxCmax的的1/20)、高靈敏度高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬和高專屬 性性(分離能力分離能力)(原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離)方法方法不必強調(diào)方法的簡便、快速；不必強調(diào)方法的簡便、快速；大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù)，如大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù)，如HPLC、LC-MS 毒毒代動力學(xué)代動力學(xué)確定新化合藥物預(yù)期人用劑量水平與其毒性水平之間的安全范圍確定新化合藥物預(yù)期人用劑量水平與其毒性水平之間的安全范圍2022

6、-6-308三、生物樣品的類型與預(yù)處理方法三、生物樣品的類型與預(yù)處理方法生物樣品的類型與預(yù)處理方法生物樣品的類型與預(yù)處理方法決定決定分析方法分析方法的應(yīng)用的應(yīng)用以血漿或血清為分析樣品以血漿或血清為分析樣品蛋白沉淀蛋白沉淀 溶劑萃取溶劑萃取分析樣品較為分析樣品較為“干凈干凈”，可用，可用HPLC或或HPLC-MS檢測檢測2022-6-309四、實驗室條件四、實驗室條件在設(shè)計體內(nèi)藥物分析方法時，還應(yīng)充分考慮在設(shè)計體內(nèi)藥物分析方法時，還應(yīng)充分考慮到實驗室現(xiàn)有的或有可能在其它實驗室使用的儀到實驗室現(xiàn)有的或有可能在其它實驗室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。器裝備，合理選擇可行的分析方法。2022

7、-6-3010第二節(jié)第二節(jié) 分析方法分析方法建立的一般步驟建立的一般步驟 2022-6-3011一、分析方法的選擇一、分析方法的選擇體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計生物樣品中的生物樣品中的藥物濃度藥物濃度決定分析方法的決定分析方法的首要因素首要因素生物樣品中藥物或其特定代謝產(chǎn)物的生物樣品中藥物或其特定代謝產(chǎn)物的濃度低、樣品量少濃度低、樣品量少難以通過難以通過增加取樣量增加取樣量提高方法靈敏度提高方法靈敏度通過通過選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟx擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟm應(yīng)樣品分析需求適應(yīng)樣品分析需求2022-6-3012二、分析方法的建立二、分析方法的建立 分析方法建立之前分析方法建立之前查閱文獻(xiàn)資料

8、查閱文獻(xiàn)資料充分了解藥物在體內(nèi)的充分了解藥物在體內(nèi)的動力學(xué)過程，動力學(xué)過程，使所使所擬定的分析方法擬定的分析方法避免受到代謝產(chǎn)物的干擾適用于實際生物樣品測定避免受到代謝產(chǎn)物的干擾適用于實際生物樣品測定2022-6-3013二、分析方法的建立二、分析方法的建立 初步擬定分析方法后初步擬定分析方法后進行一系列試驗工作進行一系列試驗工作選擇最佳分析條件選擇最佳分析條件同時同時驗證分析方法的可行性驗證分析方法的可行性確認(rèn)是否適用于實際生物樣品確認(rèn)是否適用于實際生物樣品F 分析方法的分析方法的建立建立和和驗證驗證過程過程是不可截然劃分的是不可截然劃分的 F 分析方法的建立步驟分析方法的建立步驟2022-

9、6-3014( (一一) )檢測條件的篩選檢測條件的篩選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 照擬定的分析方法(不包括生物基質(zhì)的預(yù)處理)測定 確定最佳分析檢測條件確定最佳分析檢測條件(如色譜條件)和檢測靈敏度檢測靈敏度HPLC 調(diào)整檢測器檢測器(類型、條件) 色譜柱色譜柱(型號、牌號、填料性狀與粒經(jīng)、柱長度) 流動相流動相(組分及其配比)及其流速 柱溫柱溫、進樣量進樣量、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度及其加入量等 使各物質(zhì)具有足夠的足夠的方法靈敏度方法靈敏度(LOQ) 良好的良好的色譜參數(shù)色譜參數(shù)(n、R、T) 適當(dāng)?shù)倪m當(dāng)?shù)谋Ａ魰r間保留時間(tR)2022-6-3015( (二二) )分離條件的篩選分離條件的篩選在進行分

10、離條件篩選時，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對分離與檢測的干擾，步驟如下：1空白溶劑試驗空白溶劑試驗 溶劑(方法特異性方法特異性)2空白生物基質(zhì)試驗空白生物基質(zhì)試驗 endogenous compounds(方法特異性方法特異性)3模擬生物樣品試驗?zāi)M生物樣品試驗 方法效能指標(biāo)方法效能指標(biāo)4實際生物樣品測試實際生物樣品測試 代謝產(chǎn)物(方法特異性方法特異性)2022-6-30162. 空白生物基質(zhì)試驗空白生物基質(zhì)試驗空白生物基質(zhì)空白生物基質(zhì) (blank biological matrix)如空白血漿空白血漿 考察目標(biāo)考察目標(biāo)生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)內(nèi)源性物質(zhì)對測定的干擾對測定的干擾（方法特

11、異性）在待測藥物(或特定的活性代謝物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)等)的“信號窗信號窗”（信號附近的有限范圍）內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號內(nèi)源性物質(zhì)信號2022-6-30173. 模擬生物樣品試驗?zāi)M生物樣品試驗?zāi)M生物樣品模擬生物樣品( (質(zhì)量控制質(zhì)量控制, ,QC樣品樣品) )空白生物基質(zhì)中加入待測藥物考察目標(biāo)考察目標(biāo)方法的線性范圍線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度精密度與準(zhǔn)確度、靈敏度靈敏度 藥物的萃取回收率萃取回收率等各項技術(shù)指標(biāo)同時進一步進一步檢驗生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)以及可能共同使用的其他藥物對測定的干擾程度，即方法特異性方法特異性2022-6-30184. 實際生物樣品的測試實際生物樣品的測試空白生物基質(zhì)和模擬生物

12、樣品試驗確定的分析方法及其條件不能完全確認(rèn)是否適合于實際生物樣品的測定藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合(如血漿蛋白結(jié)合物血漿蛋白結(jié)合物) 或代謝生成數(shù)個代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物及其進一步的結(jié)合物結(jié)合物(或綴合物)實際生物樣品實際生物樣品確立分析方法后，確立分析方法后，尚需進行實際生物樣品的測試尚需進行實際生物樣品的測試考察目標(biāo)考察目標(biāo)代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物對藥物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的干擾干擾情況進一步驗證方法的可行性驗證方法的可行性2022-6-3019第三節(jié)第三節(jié) 分析方法分析方法驗證的內(nèi)容與要求驗證的內(nèi)容與要求驗證步驟： 首先為分析方法分析方法的驗證 特異性、精密度與準(zhǔn)確度、回收率特異性、精密度與準(zhǔn)確度、回收率定量

13、限與檢測限、溶液穩(wěn)定性定量限與檢測限、溶液穩(wěn)定性其次為生物基質(zhì)中生物基質(zhì)中待測藥物穩(wěn)定性穩(wěn)定性的驗證 室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循環(huán)融循環(huán)2022-6-3020驗證的效能指標(biāo)與基本要求驗證的效能指標(biāo)與基本要求1特異性特異性避免干擾避免干擾2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍覆蓋所有濃度范圍覆蓋所有濃度范圍3準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度與實際狀況相符與實際狀況相符4精密度精密度結(jié)果可重現(xiàn)結(jié)果可重現(xiàn)5定量限定量限達(dá)到峰濃度的達(dá)到峰濃度的1/101/206穩(wěn)定性穩(wěn)定性確保所有樣品準(zhǔn)確測定確保所有樣品準(zhǔn)確測定7提取回收率提取回收率確保準(zhǔn)確度確保準(zhǔn)確度 8. 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng) 202

14、2-6-3021一、方法特異性一、方法特異性( (專屬性或選擇性專屬性或選擇性) )方法的特異性方法的特異性(specificity)系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時，方法準(zhǔn)確測定待測物質(zhì)的能力系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時，方法準(zhǔn)確測定待測物質(zhì)的能力比較比較待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號檢測信號對照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）空白生物基質(zhì)模擬生物樣品（空白生物基質(zhì)中添加對照品）確證確證內(nèi)源性物質(zhì)對分析方法有無內(nèi)源性物質(zhì)對分析方法有無干擾干擾2022-6-3022二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線（standard curve） calibration curve or

15、 working curve標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線用用模擬生物樣品模擬生物樣品建立建立線性范圍線性范圍(不包括不包括零點零點)應(yīng)能應(yīng)能覆蓋全部生物樣品覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度中的藥物濃度不能使用不能使用外推的方法外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度求算未知生物樣品中的藥物濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品應(yīng)使用與待測的含藥生物樣品應(yīng)使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)相同的生物基質(zhì)制備制備2022-6-3023 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度范圍標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度范圍至少含至少含59個濃度點個濃度點(不包括零點不包括零點,即空白即空白)可可覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃

16、度覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度如：如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式等比梯度模式比例常數(shù)約為比例常數(shù)約為 2)若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為50，其，其1/20為為2.5設(shè)定最高濃度為設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為，最低濃度為1 (個體差異個體差異)實際制備時：實際制備時：500、250、100、50、20、10 2022-6-3024 標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備 空白生物基質(zhì)空白生物基質(zhì)(如血漿如血漿)加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量，渦旋混勻加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量，渦旋混勻為防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合時造成的損失為防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混

17、合時造成的損失先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液 再加入空白生物基質(zhì)再加入空白生物基質(zhì) 渦旋混勻渦旋混勻 2022-6-3025標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)曲線的限度要求限度要求藥代動力學(xué)或生物利用度研究藥代動力學(xué)或生物利用度研究標(biāo)準(zhǔn)曲線至少包括標(biāo)準(zhǔn)曲線至少包括5個濃度個濃度(通常為通常為59個濃度個濃度,不包括零點不包括零點)最高濃度應(yīng)高于達(dá)峰濃度最高濃度應(yīng)高于達(dá)峰濃度(Cmax)；最低濃度應(yīng)低于；最低濃度應(yīng)低于Cmax的的10%5%，并應(yīng)為方法的，并應(yīng)為方法的LOQ(非非LOD)相關(guān)系數(shù)要求相關(guān)系數(shù)要求 0.99(色譜法色譜法) 低濃度點準(zhǔn)確度為真實值低濃度點準(zhǔn)確度為真實值80%-120%，其余點為，其余點為

18、85%-115%。 2022-6-3026三、準(zhǔn)確度三、準(zhǔn)確度方法準(zhǔn)確度方法準(zhǔn)確度(accuracy)系指用該方法系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度與其真實濃度的接近程度應(yīng)使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃應(yīng)使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的所以，通常使用模擬生物樣品測定度是未知的所以，通常使用模擬生物樣品測定2022-6-3027四、精密度四、精密度方法精密度方法精密度(precision )系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的偏離程度偏離程度表示該分析方法的表示該分析方法的

19、可重復(fù)性可重復(fù)性(reproducibility)反映分析方法的反映分析方法的可操作可操作性，是方法驗證的基本要點之一性，是方法驗證的基本要點之一實際生物樣品的量有限實際生物樣品的量有限(如血漿，一般為如血漿，一般為0.12ml)使用模擬生物樣品測定使用模擬生物樣品測定 2022-6-30281. 1. 表示方法表示方法方法精密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差方法精密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)或或相對標(biāo)準(zhǔn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差偏差(relative standard deviation，RSD)表示表示 SD=RSD= =包括批內(nèi)包括批內(nèi)(within-run或或intra-assa

20、y)RSD日內(nèi)日內(nèi)(within-day) 和批間和批間(between-run或或inter-assay)RSD日間日間(between-day，day-to-day)112nXXniii）（%100XSD）（%100112XnXXniii2022-6-30292. 2. 測定法測定法分別測定法分別測定法()照準(zhǔn)確度項下方法，取空白生物基質(zhì)照準(zhǔn)確度項下方法，取空白生物基質(zhì)(如血漿如血漿)數(shù)份，分別在同一數(shù)份，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低批內(nèi)和不同批間制備高、中、低 3個濃度的個濃度的QC樣品，并分析測定樣品，并分析測定批內(nèi)批內(nèi)RSD每一濃度每一濃度5個樣品，每個樣品測定個樣品，每個

21、樣品測定1次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算別計算3個濃度及每個濃度及每1濃度的濃度的RSD批間批間RSD每每1分析批內(nèi)每一濃度制備分析批內(nèi)每一濃度制備1個樣品，每個樣品測定個樣品，每個樣品測定1次；用次；用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算3個濃度個濃度(每一濃度每一濃度3個分析批數(shù)據(jù)個分析批數(shù)據(jù))的的RSD2022-6-30303. 3. 限度要求限度要求在藥代動力學(xué)和生物利用度研究中在藥代動力學(xué)和生物利用度研究中對對 g/ml級水平的級水平的RSD一般應(yīng)一般應(yīng)10%ng/ml級水平的級水平的RSD一般應(yīng)一般應(yīng)15%在在LOQ附近附近RSD應(yīng)應(yīng)20%。 2022-6-3031五、

22、定量限五、定量限方法定量限方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系指在保證具有一定可靠性系指在保證具有一定可靠性(準(zhǔn)確度與精密度符合要求準(zhǔn)確度與精密度符合要求)的前的前提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度又稱為方法靈敏度又稱為方法靈敏度(sensitivity)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(最低濃度點最低濃度點LOQ)要求要求 應(yīng)能滿足測定應(yīng)能滿足測定35個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度準(zhǔn)確度在準(zhǔn)確度在80%120%(或或RE在在20%的范圍內(nèi)的范圍內(nèi))RSD20%2022-6

23、-3032六、穩(wěn)定性與質(zhì)量控制六、穩(wěn)定性與質(zhì)量控制穩(wěn)定性穩(wěn)定性包括方法穩(wěn)定性和樣品穩(wěn)定性包括方法穩(wěn)定性和樣品穩(wěn)定性方法穩(wěn)定性方法穩(wěn)定性方法的耐用性方法的耐用性樣品穩(wěn)定性樣品穩(wěn)定性生物樣品的存放條件和時間、凍生物樣品的存放條件和時間、凍-融循環(huán)融循環(huán)測定法測定法QC樣品穿插于實際樣品測定全過程樣品穿插于實際樣品測定全過程模擬模擬(或?qū)嶋H或?qū)嶋H)生物樣品及其預(yù)處理后的待測溶液進行考察生物樣品及其預(yù)處理后的待測溶液進行考察要求要求 準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度85%115%(RE在在15%范圍內(nèi)范圍內(nèi))，RSD15%2022-6-3033七、提取回收率七、提取回收率生物樣品的預(yù)處理方法生物樣品的預(yù)處理方法提取回收率，提取回收率，70%取空白生物基質(zhì)取空白生物基質(zhì)(如血漿如血漿)，照準(zhǔn)確度項下方法，制備高、中、低，照準(zhǔn)確度項下方法，制備高、中、低3個濃個濃度的度的QC樣品樣品(每一濃度至少每一濃度至少5個樣品個樣品)，每個樣品分析測定，每個樣品分析測定1次次另取等量的相同另取等量的相同3個濃度的含