1、12PCR原理原理 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。 優點：特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、優點：特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等易自動化等 能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀使肉眼能直接觀察和判斷；察和判斷； 可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出

2、足量的的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用做到的事情，用PCR幾小時便可完成。幾小時便可完成。PCR技術是生技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑 3PCR技術簡史技術簡史 本世紀本世紀60年代末、年代末、70年代初人們致力于年代初人們致力于研究基因的體外分離技術研究基因的體外分離技術 Korana于于1971年最早提出核酸體外擴增年最早提出核酸體外擴增的設想：的設想：“經過經過DNA變性，與合適的引變性，與合適的引物雜交，用物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不聚合酶延伸引物，并不斷重復

3、該過程便可克隆斷重復該過程便可克隆tRNA基因基因”。4發展發展 1985年美國年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究公司人類遺傳研究室的室的Mullis等發明了具有劃時代意義的等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體的體內復制，只是在試管中給內復制，只是在試管中給 DNA的體外合的體外合成提供以致一種合適的條件成提供以致一種合適的條件-摸板摸板DNA，寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩聚合酶，合適的緩沖體系，沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度變性、復性及延伸的溫度與時間。與時間。5實現實現 Mullis最初使用的最初使用的DNA

4、聚合酶是大腸桿菌聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的 Klenow片段，片段， 其缺點是：其缺點是： Klenow酶不耐高溫，酶不耐高溫，90會變性失活，每會變性失活，每次循環都要重新加。次循環都要重新加。 引物鏈延伸反應在引物鏈延伸反應在37下進行，容易發生模下進行，容易發生模板和引物之板和引物之 間的堿基錯配，其間的堿基錯配，其PCR產物特異產物特異性較差，合成的性較差，合成的DNA片段不均一。片段不均一。 6改進改進 1988年初，年初，Keohanog改用改用T4 DNA聚合聚合酶進行酶進行PCR，其擴增的，其擴增的DNA片段很均一，片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種真實性

5、也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。片段。但每循環一次，仍需加入新酶。 7完善完善 1988年年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱DNA聚合酶。聚合酶。 特點：特點： 耐高溫，在耐高溫，在70下反應下反應2h后其殘留活性大于后其殘留活性大于原來的原來的90%，在，在93下反應下反應2h后其殘留活性是后其殘留活性是原來的原來的 60%，在，在95下反應下反應2h后其殘留活性后其殘留活性是原來的是原來的40%。 在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反在熱變性

6、時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。應后再加新酶。 大大提高了擴增片段特異性和擴增效大大提高了擴增片段特異性和擴增效 率，增率，增加了擴增長度加了擴增長度(2.0Kb)。8 由于提高了擴增的特異性和效率，因而由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶聚酶I Klenow片段區別，將此酶命名為片段區別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現使此酶的發現使PCR廣泛的被應用。廣泛的被應用。 9PCR技術基本原理技術基本原理 PCR技術的基本原理類似于技術的基本原理類似于DNA

7、的天然的天然復制過程，復制過程， 其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。核苷酸引物。 PCR由變性由變性-退火退火-延伸三個基本反應步延伸三個基本反應步驟構成驟構成 10基本步驟基本步驟 模板模板DNA的變性：模板的變性：模板DNA經加經加 熱至熱至93左右一定時間后，使模板左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；以便它與引物結合，為下輪反應作準備； 模板模板DNA與引物的退火與引物的退火(復性復性)：模板：模板DNA經經加熱變性成單

8、鏈后，溫度降至加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物左右，引物與模板與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；單鏈的互補序列配對結合； 11 引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物結合引物結合 物物在在TaqDNA聚合酶的作用下，以聚合酶的作用下，以dNTP為為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模與半保留復制原理，合成一條新的與模板板DNA 鏈互補的半保留復制鏈鏈互補的半保留復制鏈12 重復循環變性重復循環變性-退火退火-延伸三過程，就可延伸三過程，就可獲得更多的獲得更多的“半保留復制鏈半保留復制鏈”，而且這，而且這種新鏈又可

9、成為下次循環的模板。種新鏈又可成為下次循環的模板。 每完成一個循環需每完成一個循環需 24分鐘，分鐘，23小時小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期所需循環次數取決于樣品中到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。模板的拷貝。 13PCR的反應動力學的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。擴增量呈指數上升。 DNA 擴增量可用擴增量可用Y(1X)n計算計算 Y代表代表DNA片段擴增后的拷貝數，片段擴增后的拷貝數，X表表示平示平(Y)均每次的擴增效率，均每次的擴增效率，n代表循環代表循環次

10、數。次數。 平均擴增效率的理論值為平均擴增效率的理論值為100% 14 反應初期，靶序列反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指片段的增加呈指數形式數形式 隨著隨著PCR產物的逐漸積累，進入線性增產物的逐漸積累，進入線性增長期或靜止期，即出現長期或靜止期，即出現“停滯效應停滯效應”， 這種效應稱平臺期數、這種效應稱平臺期數、PCR擴增效率及擴增效率及DNA聚合酶聚合酶PCR的種類和活性及非特異的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情況下，性產物的竟爭等因素。大多數情況下，平臺期的到來是不可避免的。平臺期的到來是不可避免的。 15PCR反應體系與反應條件反應體系與反應條件 標準的標準的PCR

11、反應體系：反應體系： 10擴增緩沖液擴增緩沖液10ul 4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物各引物各10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ul 16PCR反應五要素反應五要素 引物、酶、引物、酶、dNTP、模板和、模板和Mg2+ 引物：引物是引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板任何一段模板DNA序列，就能按

12、其設序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板就可將模板DNA在體外大量擴增。在體外大量擴增。 17 Mg2+濃度：濃度：Mg2+對對PCR擴增的特異性擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的和產量有顯著的影響，在一般的PCR反反應中，各種應中，各種dNTP濃度為濃度為200umol/L時，時，Mg2+濃度為濃度為1.52.0mmol/L為宜。為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。聚合酶的活性，使反應產物減少。18

13、PCR反應條件的選擇反應條件的選擇 溫度、時間和循環次數溫度、時間和循環次數 溫度與時間的設置：溫度與時間的設置： 基于基于PCR原理三原理三步驟而設置變性步驟而設置變性-退火退火-延伸三個溫度點。延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈雙鏈DNA在在9095變性，變性，再迅速冷卻至再迅速冷卻至40 60，引物退火并，引物退火并結合到靶序列上，結合到靶序列上，1. 然后快速升溫至然后快速升溫至7075，19循環次數循環次數 循環次數決定循環次數決定PCR擴增程度。擴增程度。 PCR循環次數主要取決于模板循環次數主要取決于模板DNA的濃的濃度。度。 一般的循環

14、次數選在一般的循環次數選在3040次之間，次之間， 循環次數越多，非特異性產物的量亦隨循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。之增多。20PCR反應特點反應特點 特異性強特異性強 引物與模板引物與模板DNA特異正確的結合；特異正確的結合；堿基配對原則；堿基配對原則；Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；聚合酶合成反應的忠實性；靶基因的特異性與保守性。靶基因的特異性與保守性。 靈敏度高靈敏度高 對標本的純度要求低對標本的純度要求低 21分析方法分析方法 凝膠電泳分析：凝膠電泳分析：PCR產物電泳，產物電泳，EB溴乙溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。

15、特異性。PCR產物片段的大小應與預計產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重的一致，特別是多重PCR，應用多對引，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。這是起碼條件。 22 瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用通常應用12%的瓊的瓊脂糖凝膠，供檢測用。脂糖凝膠，供檢測用。 聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳：610%聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。比較集中，可用于科研及檢測分析。 23 酶切分析：根據酶切分析：根據PCR產物中限制性內切產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特產物特異性的有力證據，也是檢測異性的有力證據，也是檢測PCR 產物堿產物堿基突變的有效方法?；蛔兊挠行Х椒?。 24 Southern印跡雜交：印跡雜交： 在兩引物之間另合在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸內部寡核苷酸)標記標記后做