1、1食品生物技術導論2目 錄o第一章第一章 緒緒 論論o第二章第二章 食品與基因工程食品與基因工程o第三章第三章 食品與蛋白質工程食品與蛋白質工程o第四章第四章 食品與酶工程食品與酶工程o第五章第五章 食品與發酵工程食品與發酵工程o第六章第六章 食品與細胞工程食品與細胞工程o第七章第七章 食品生物工程中的下游過程食品生物工程中的下游過程o第八章第八章 食品生物技術與食品安全檢測食品生物技術與食品安全檢測o第九章第九章 生物技術與食品工業生物技術與食品工業“三廢三廢”治理治理3第一章第一章 緒緒 論論n第一節第一節 食品生物技術涵義食品生物技術涵義n第二節第二節 食品生物技術研究內容食品生物技術研

2、究內容n第三節第三節 食品生物技術特點食品生物技術特點n第四節第四節 食品生物技術發展簡史食品生物技術發展簡史n第五節第五節 分子生物學的形成和發展分子生物學的形成和發展4第一節第一節 食品生物技術涵義食品生物技術涵義一、生物技術一、生物技術l所謂生物工程是達到特殊目的生物過程的控制性工程所謂生物工程是達到特殊目的生物過程的控制性工程 “操縱生操縱生物物 （微生物、植物、動物）的細胞、組織或酶，進行生物合成（微生物、植物、動物）的細胞、組織或酶，進行生物合成及分解轉化及分解轉化”。 二、食品生物技術二、食品生物技術l食品生物技術（食品生物技術（food biotechnology）是利用生物體

3、及其細胞、）是利用生物體及其細胞、亞細胞和分子組成部分，結合工程學、信息學等手段去研究及加亞細胞和分子組成部分，結合工程學、信息學等手段去研究及加工處理或制造食品產品的新技術。工處理或制造食品產品的新技術。 5第二節第二節 食品生物技術研究內容食品生物技術研究內容一、食品與基因工程一、食品與基因工程l基因工程又稱遺傳工程，它是在體外將異源基因工程又稱遺傳工程，它是在體外將異源DNA（目的基因）與基（目的基因）與基因載體（質粒、病毒等）重組成復制子并轉移至宿主細胞的過程。因載體（質粒、病毒等）重組成復制子并轉移至宿主細胞的過程。 二、食品與酶工程二、食品與酶工程l酶是活細胞產生的具高度催化活性和

4、高度專一性的生物催化劑。酶是活細胞產生的具高度催化活性和高度專一性的生物催化劑。l所謂酶工程是把酶或細胞或經過修飾后直接應用于化學反應的生物催所謂酶工程是把酶或細胞或經過修飾后直接應用于化學反應的生物催化工程，包括固定化酶、固定化細胞和固定化活細胞體系等。化工程，包括固定化酶、固定化細胞和固定化活細胞體系等。l酶工程的應用能有效地改造傳統的食品工業。酶工程的應用能有效地改造傳統的食品工業。 6三、食品與發酵工程三、食品與發酵工程n發酵工程其涵義是采用現代發酵設備，使經基因重組技術改良的細胞發酵工程其涵義是采用現代發酵設備，使經基因重組技術改良的細胞或經其它現代技術改造的菌株進行放大培養和控制發

5、酵，獲得工業化或經其它現代技術改造的菌株進行放大培養和控制發酵，獲得工業化生產預定的食品產品或食品的功能成分。生產預定的食品產品或食品的功能成分。 四、食品與細胞工程四、食品與細胞工程l應用細胞生物學方法，按照人們預定的設計，有計劃地改造遺傳物質應用細胞生物學方法，按照人們預定的設計，有計劃地改造遺傳物質和細胞培養技術，包括細胞融合技術、細胞拆合技術以及動物、植物和細胞培養技術，包括細胞融合技術、細胞拆合技術以及動物、植物大量控制性培養技術，還包括染色體工程和細胞質工程等內容。大量控制性培養技術，還包括染色體工程和細胞質工程等內容。 l細胞工程與微生物細胞培養一樣，在人工控制條件下在生物反應器

6、中細胞工程與微生物細胞培養一樣，在人工控制條件下在生物反應器中大規模培養，獲得人類所需要的各種食品產品及保健產品大規模培養，獲得人類所需要的各種食品產品及保健產品 7五、食品與蛋白質工程五、食品與蛋白質工程n1983年美國年美國Genex 公司公司KUtrner提出蛋白質工程（提出蛋白質工程（protein engineering）概念，其涵義是指從蛋白質分子結構的設計入手，將待改進的蛋白質提概念，其涵義是指從蛋白質分子結構的設計入手，將待改進的蛋白質提純為結晶，用純為結晶，用x射線衍射等手段研究其空間構象，確定其需要改變的氨射線衍射等手段研究其空間構象，確定其需要改變的氨基酸殘基，然后再用基

7、因定位突變和體外定向進化等方法達到修飾蛋白基酸殘基，然后再用基因定位突變和體外定向進化等方法達到修飾蛋白質分子空間結構的目的。質分子空間結構的目的。 六、食品與后基因組學六、食品與后基因組學l2003年隨著人類基因組圖譜草圖繪制成功，為后基因組學（年隨著人類基因組圖譜草圖繪制成功，為后基因組學（post-genomics）的誕生拉開了序幕。而現代研究認為，一個基因可以編碼數）的誕生拉開了序幕。而現代研究認為，一個基因可以編碼數個蛋白質，隨之形成所謂基因組學（個蛋白質，隨之形成所謂基因組學（genomics）和蛋白質組學）和蛋白質組學（proteomics），近年來，在日本、美國和德國等國又啟動

8、了營養基因），近年來，在日本、美國和德國等國又啟動了營養基因組學（組學（nutrigenomics）的研究。）的研究。 8七、食品與食品安全七、食品與食品安全n生物技術的發展為食品安全的檢測提供高速高效的生物技術的發展為食品安全的檢測提供高速高效的PCR系統檢測技術。系統檢測技術。為加強食品安全在食品加工過程除必須嚴格執行為加強食品安全在食品加工過程除必須嚴格執行CAC、HACCP、GMP和和ACP安全體系外。還必須制訂切實可行的食品安全監督管理安全體系外。還必須制訂切實可行的食品安全監督管理體系。體系。 9第三節第三節 食品生物技術特點食品生物技術特點一、食品生物技術與食品產業化緊密相關一、

9、食品生物技術與食品產業化緊密相關l食品生物技術對改造傳統食品工食品生物技術對改造傳統食品工業和農副產品深加工，具有革命業和農副產品深加工，具有革命性意義和較大的經濟價值。食品性意義和較大的經濟價值。食品生物技術即食品生物工程包括上生物技術即食品生物工程包括上游工程（游工程（up stream process）和下）和下游工程（游工程（down stream process），），整個過程有多個操作工序，一環整個過程有多個操作工序，一環扣一環，核心技術為生物技術和扣一環，核心技術為生物技術和酶工程，形成較為完整的產業鏈，酶工程，形成較為完整的產業鏈，如圖如圖1-1所示。所示。 圖圖1-1 食品生

10、物技術產業鏈示意圖食品生物技術產業鏈示意圖10二、食品生物技術屬邊緣性交叉學科二、食品生物技術屬邊緣性交叉學科n生物技術是研究生命的科學技術，是生物科學和工程學綜合交叉的邊生物技術是研究生命的科學技術，是生物科學和工程學綜合交叉的邊緣學科。緣學科。 三、食品生物技術具有三、食品生物技術具有“六高六高”基本特征基本特征l食品生物技術與其他高新技術一樣，對國民經濟的發展和食品工業的食品生物技術與其他高新技術一樣，對國民經濟的發展和食品工業的革新具有革新具有“六高六高”的基本特征：即高效益，高智力、高投入、高競爭、的基本特征：即高效益，高智力、高投入、高競爭、高風險和高潛力。高風險和高潛力。 四、食

11、品生物技術屬高新技術范疇四、食品生物技術屬高新技術范疇l根據當今世界科技發展對世界經濟發展貢獻情況。信息、能源、生物根據當今世界科技發展對世界經濟發展貢獻情況。信息、能源、生物技術、航天、材料、汽車和環境等己被列為世界技術、航天、材料、汽車和環境等己被列為世界“七大七大”高科技領域。高科技領域。 11五、食品生物技術已成為食品科學發展的重要研究方向五、食品生物技術已成為食品科學發展的重要研究方向n食品生物技術作為生物技術的分支學科，在自然科學中涵蓋范圍廣為食品生物技術作為生物技術的分支學科，在自然科學中涵蓋范圍廣為其特征。其特征。 第四節第四節 食品生物技術發展簡史食品生物技術發展簡史一、史前

12、時期一、史前時期l從出土文物發現，追溯至距今數千多年前的龍山文化時期。釀酒、制從出土文物發現，追溯至距今數千多年前的龍山文化時期。釀酒、制醋和制醬等發酵技藝已經發展到世界一流水平。醋和制醬等發酵技藝已經發展到世界一流水平。 12二、近代時期二、近代時期n從從19世紀世紀50年代開始，伴隨著歐洲的文藝復興帶來科學和工業的繁榮。年代開始，伴隨著歐洲的文藝復興帶來科學和工業的繁榮。由于法國科學家巴斯德（由于法國科學家巴斯德（Pasteur）對微生物學創立的貢獻，德國科學）對微生物學創立的貢獻，德國科學家柯赫（家柯赫（Koch）發明了微生物的分離和純種培養技術和法國學者布）發明了微生物的分離和純種培養

13、技術和法國學者布合乃爾（合乃爾（Buchner）兄弟倆通過實驗揭示了發酵本質是細胞中酶的作）兄弟倆通過實驗揭示了發酵本質是細胞中酶的作用。標志著傳統食品生物技術向近代食品生物技術的發展。從傳統發用。標志著傳統食品生物技術向近代食品生物技術的發展。從傳統發酵食品的生產靠天然微生物作用酵食品的生產靠天然微生物作用 。三、現代的發展三、現代的發展l從從20世紀世紀50年代初開始，伴隨著生物化學，遺傳學和化學分析技術的年代初開始，伴隨著生物化學，遺傳學和化學分析技術的發展。特別是發展。特別是1953年年“DNA雙螺旋結構雙螺旋結構”的發現、的發現、1969年酶固定化技年酶固定化技術的應用成果和術的應用

14、成果和1973年基因工程誕生等重大科技成就為標志的劃時代年基因工程誕生等重大科技成就為標志的劃時代發展發展 13第五節第五節 分子生物學的形成和發展分子生物學的形成和發展一、細胞學說一、細胞學說l在在19世紀中時施萊登和施旺（世紀中時施萊登和施旺（Schwann）兩位學者經過）兩位學者經過20年的研究繪年的研究繪出有關細胞結構明顯圖象和細胞組成，從而創立了細胞學說。出有關細胞結構明顯圖象和細胞組成，從而創立了細胞學說。 二、生物進化論二、生物進化論l奧地利學者格里哥爾奧地利學者格里哥爾.孟德爾（孟德爾（Gregor Mendel）研究認為，遺傳性狀）研究認為，遺傳性狀是由一對遺傳因子決定的，是

15、由一對遺傳因子決定的， 14四、摩爾根的基因學說四、摩爾根的基因學說n摩爾根提出：摩爾根提出：“物質必須由某種獨立的要素組成，正是這些要素我們物質必須由某種獨立的要素組成，正是這些要素我們叫做遺傳因子，或者更簡單地叫做基因叫做遺傳因子，或者更簡單地叫做基因”。五、基因本質的發現五、基因本質的發現l摩爾根提出：摩爾根提出：“物質必須由某種獨立的要素組成，正是這些要素我們物質必須由某種獨立的要素組成，正是這些要素我們叫做遺傳因子，或者更簡單地叫做基因叫做遺傳因子，或者更簡單地叫做基因”。多年來研究證實這種轉化。多年來研究證實這種轉化物質就是物質就是DNA，這是基因本質的重大發現。，這是基因本質的重

16、大發現。 15六、分子生物學的誕生六、分子生物學的誕生n1953年美國遺傳學家詹姆斯年美國遺傳學家詹姆斯.沃森（沃森（James D .Watson）和英國生物物理學家弗朗西斯）和英國生物物理學家弗朗西斯.克里克克里克（Francis crick）根據莫）根據莫.休休.弗弗.威爾金斯（威爾金斯（M.H.F.wilkins）的）的x-射線衍射等系列圖譜結構分析射線衍射等系列圖譜結構分析基礎上，用標度分子模型在英國基礎上，用標度分子模型在英國Max Perutz教授分子生物學實驗室進行研究。其研究成果，教授分子生物學實驗室進行研究。其研究成果，在英國在英國自然自然雜志上發表的雜志上發表的DNA結構

17、結構一文，提出了一文，提出了“DNA雙螺旋結構模型雙螺旋結構模型”。首次闡。首次闡明了明了D結構與功能，為遺傳信息的貯存、傳遞和利用提供了科學依據，創立了現代分子結構與功能，為遺傳信息的貯存、傳遞和利用提供了科學依據，創立了現代分子生物學。這是生物學。這是20世紀科學史上劃時代的里程碑。世紀科學史上劃時代的里程碑。Watson和和crick均為諾貝爾獎獲得者。均為諾貝爾獎獲得者。DNA雙雙螺旋結構分子模型如圖螺旋結構分子模型如圖1-1、1-2所示其結構要點說明如下：所示其結構要點說明如下： 圖圖1-1 DNA分子雙螺旋結構模型分子雙螺旋結構模型圖圖1-2 DNA雙螺旋結構分子模型雙螺旋結構分子

18、模型 16n（1）DNA是由兩條極性相反并互補的多聚核苷酸鏈，圍繞中心軸的是由兩條極性相反并互補的多聚核苷酸鏈，圍繞中心軸的雙螺旋結構。此螺旋為右螺旋，并存在大溝和小溝。雙螺旋結構。此螺旋為右螺旋，并存在大溝和小溝。n（2）兩條鏈中堿基之間按照）兩條鏈中堿基之間按照A配對配對T、G配對配對C的互補原則，的互補原則，DNA兩兩鏈間的維系主要靠氫鍵，其中鏈間的維系主要靠氫鍵，其中A與與T之間形成二個氫鍵，之間形成二個氫鍵，G與與C之間形之間形成三個氫鍵。成三個氫鍵。n（3）雙螺旋的直徑為）雙螺旋的直徑為2nm，兩個相鄰堿基的間距為，兩個相鄰堿基的間距為0.34nm，每，每10個個堿基的間距為堿基的

19、間距為3.4nm，構成一段完整的螺旋結構，其相鄰堿基的夾角，構成一段完整的螺旋結構，其相鄰堿基的夾角為為36。n（4）兩條多聚核苷酸鏈間堿基配對的互補規律為：）兩條多聚核苷酸鏈間堿基配對的互補規律為：A配對配對T或或T配對配對A、G配對配對C或或C配對配對G，而且其分子比率為，而且其分子比率為1。17n（1）DNA分子能自我復制根據分子能自我復制根據DNA雙螺結構模型，在兩條多聚核雙螺結構模型，在兩條多聚核苷酸鏈中，任何一條都可以作為另苷酸鏈中，任何一條都可以作為另一條生物合成的模板，這一點明顯一條生物合成的模板，這一點明顯地不同于其它生物大分子。經過自地不同于其它生物大分子。經過自我復制出來

20、的每一個我復制出來的每一個DNA分子中的分子中的一條鏈被保留下來。這種復制，稱一條鏈被保留下來。這種復制，稱為半保留復制（為半保留復制（Semi conservative replication）（如圖）（如圖1-3）。）。 n（2）DNA是遺傳基因的載體是遺傳基因的載體 可以從分子水平上闡明其生物學功能：可以從分子水平上闡明其生物學功能：圖圖1-3 半保留復制示意圖半保留復制示意圖18n（3）DNA雙螺旋結構模型為遺雙螺旋結構模型為遺傳信息的保存、傳遞和利用提供傳信息的保存、傳遞和利用提供了基礎。同時，根據了基礎。同時，根據1970年年Crick等人提出的分子生物學中心法則，等人提出的分子生

21、物學中心法則，如圖如圖1-4所示。所示。 n（4）DNA的調節功能的調節功能1961年，法年，法國 分 子 生 物 學 家國 分 子 生 物 學 家 F. J a c o b 和和J.Monod首次證實在大腸桿菌（）首次證實在大腸桿菌（）基因調節事實，提出了乳糖操縱基因調節事實，提出了乳糖操縱子（子（Lac Operon）假說。）假說。 圖圖1-4 分子生物學中心法則分子生物學中心法則5l應用乳糖操縱子假說，從分子水平上闡明基因控制蛋白質的誘導合成應用乳糖操縱子假說，從分子水平上闡明基因控制蛋白質的誘導合成另一種酶合成調節與酶的誘導合成機制不同，稱為酶的反饋阻遏。另一種酶合成調節與酶的誘導合成

22、機制不同，稱為酶的反饋阻遏。 19n第一節第一節 概概 述述n第二節第二節 工具酶工具酶n第三節第三節 目的基因制備目的基因制備n第四節第四節 基因載體基因載體n第五節第五節 基因重組基因重組n第六節第六節 轉化、增殖和表達轉化、增殖和表達n第七節第七節 基因工程在食品工業中應用基因工程在食品工業中應用n第八節第八節 后基因組學及其應用研究后基因組學及其應用研究第二章第二章 食品與基因工程食品與基因工程20第一節第一節 概概 述述一、基因工程的誕生一、基因工程的誕生l1973年年S.N.Cohen等在美國科學院學報（等在美國科學院學報（PNAS）上發表了題為）上發表了題為“Constructi

23、on of Biological Functional Bacterial Plasmid in Vitro”，闡明了體外構建的細菌質粒能夠在細胞中進行表達，標志著基因工程闡明了體外構建的細菌質粒能夠在細胞中進行表達，標志著基因工程的誕生的誕生 21二、基因工程涵義、特點及其操作步驟二、基因工程涵義、特點及其操作步驟n基因工程（基因工程（gene engineering）又稱）又稱為分子克隆（為分子克隆（molecular cloning）或）或重組重組DNA技術（技術（recombinant DNA Technology），其涵義為：用酶學），其涵義為：用酶學方法，將異源基因與載體方法，將異

24、源基因與載體DNA在體在體外進行重組，將形成的重組子外進行重組，將形成的重組子DNA導入宿體細胞，使異源基因在宿體導入宿體細胞，使異源基因在宿體細胞中復制表達，從而達到改造生細胞中復制表達，從而達到改造生物品種或性狀，大量生產出人類所物品種或性狀，大量生產出人類所需要生物品種和產物。需要生物品種和產物。n基因工程操作過程如圖基因工程操作過程如圖2-1所示。所示。圖圖2-1基因工程操作過程示意圖基因工程操作過程示意圖222三、基因工程的發展三、基因工程的發展n1977年英國分子生物學家年英國分子生物學家F.Sanger發明了快速發明了快速DNA測序技術并首先完測序技術并首先完成的全長成的全長53

25、87bp的的174噬菌體基因組全序列的測定噬菌體基因組全序列的測定 。n1982年第一個由基因工程菌生產的藥物胰島素已在美國和英國獲準使年第一個由基因工程菌生產的藥物胰島素已在美國和英國獲準使用。用。 n1983年第一個轉基因植物培育成功，年第一個轉基因植物培育成功，1992年第一個轉基因玉米及轉基年第一個轉基因玉米及轉基因小麥植株誕生，因小麥植株誕生，1994年轉基因番茄上市。年轉基因番茄上市。1996年完成了酵母基因組年完成了酵母基因組DNA（125105bp）的全序列測定。）的全序列測定。2003年年人類基因組計劃人類基因組計劃經過經過20多年努力已宣布草圖描繪成功。為后基因組時代的誕生

26、拉開了序多年努力已宣布草圖描繪成功。為后基因組時代的誕生拉開了序幕幕 。23第二節第二節 工具酶工具酶n在基因工程中應用的酶統稱為工具酶（在基因工程中應用的酶統稱為工具酶（enzyme of tools）。）。 l一、限制性內切酶種類一、限制性內切酶種類l限制性內切酶有三種類型：限制性內切酶有三種類型：I型酶、型酶、II型酶和型酶和III型酶。型酶。 lII型酶分子量較小，大約型酶分子量較小，大約20-100kD，是一種簡單的單功能酶，作用時，是一種簡單的單功能酶，作用時無需輔助因子或只需無需輔助因子或只需Mg2+，能識別雙鏈，能識別雙鏈DNA上特異的核苷酸序列，上特異的核苷酸序列，同時專一性

27、強，而且其識別序列與切割序列相一致。這類酶特別適合同時專一性強，而且其識別序列與切割序列相一致。這類酶特別適合于基因工程操作。于基因工程操作。 l二、限制性內切酶命名二、限制性內切酶命名l1973年，年，H.O.Smith和和Nathaus提出限制性內切酶的命名原則提出限制性內切酶的命名原則 一、限制性內切酶一、限制性內切酶l限制性內切酶（限制性內切酶（restriction endonuclease 簡稱簡稱RE）是一類專一性很強）是一類專一性很強的核酸內切酶的核酸內切酶 24l三、限制性內切酶的作用機制和作用方式三、限制性內切酶的作用機制和作用方式n如圖如圖2-2所示所示圖圖2-2限制性核

28、酸內切酶作用機制限制性核酸內切酶作用機制 l其作用方式及識別位點有如下幾種：其作用方式及識別位點有如下幾種：l1.識別不同的特異核苷酸序列識別不同的特異核苷酸序列lEcoR I識別識別lHae I識別識別 53GAATTC 5()()3 ATGGCCTA25nAsu I識別識別 nEcoR II識別識別nMbo I識別識別 n注：注：表示切割表示切割5-磷酸二酯鍵位置。磷酸二酯鍵位置。n2.識別序列皆具有回文結構識別序列皆具有回文結構n3.切割后形成各種粘性末端或平整末端，按其切割雙鏈的方式可分切割后形成各種粘性末端或平整末端，按其切割雙鏈的方式可分兩種：粘性末端和平整末端。兩種：粘性末端和平

29、整末端。 53 GGACC5( )3 ACCGGT53 GATC5335GGATCCGGATCCCCTAGGGGATCC正讀時為反讀時為l限制性內切酶錯位切割限制性內切酶錯位切割DNA雙鏈而形成彼此互補的單鏈末端，稱雙鏈而形成彼此互補的單鏈末端，稱為粘性末端（為粘性末端（Cohesion ends）。）。 26n另一種是在同一位點平齊切割另一種是在同一位點平齊切割DNA兩條鏈而形成的雙鏈末端，稱為平整末端兩條鏈而形成的雙鏈末端，稱為平整末端（Flush ends）。如）。如Alu I的識別序列為：的識別序列為：l4.切割后形成異源二聚體切割后形成異源二聚體l四、限制性內切酶識別序列及反應系統四

30、、限制性內切酶識別序列及反應系統l限制性核酸內切酶在雙鏈限制性核酸內切酶在雙鏈DNA上能夠識別的特殊核苷酸序列稱為識別序列。上能夠識別的特殊核苷酸序列稱為識別序列。l稀切酶（稀切酶（rare cuting enzymes），如表），如表2-1所示所示 ，同裂酶（，同裂酶（isoschizomer）如表）如表2-2所所示。同尾酶（示。同尾酶（isocaudamer），如表），如表2-3所示。所示。 27表表2-1 部分限制性內切稀切酶部分限制性內切稀切酶2稀切酶切 割 位 點 數識別序列Ad2SV40X174M13mp7PBr322T7TPAA.DFseIGGCCGGCCO30000001Not

31、IGCGGCCGC070000000RsrIICGGWCCG520000110SfiIGGCCN5CCGG031000112SgrICrCCGGyG760001000SwaIATTT/AAAT011010101表表2-2 具有相同切割位點的同裂酶具有相同切割位點的同裂酶28表表2-3 部分限制性核酸內切同尾酶部分限制性核酸內切同尾酶2黏性末端限 制 性 核 酸 內 切 酶5CATGAflIII，DsaI，NcoI，StyI，BspHI5GATCSau3A，NdeII，BglII，XhoII，BamHI，MleI，BelI5GGCCEclXI，EaeI5CGCGMluI，AflIII，BssHI

32、I，DsaI5CCGGCfr10，AgeI，XmaI，AvaI，MorI5TCGASaeI，XhoI，AvaI5GTACSap718，BanI，SphI5CTAGSpeI，NheI，AvrII，StyI，XbaI5CGMaeI，AcyI，HinPI，NarI，HpaII，MspI，TaqI，ClaI，AccI，SfuI5TANdeI，MaeI，MseI，AsnICATG3NlaIII，NspI，SphIAGCT3SacI，BanII，BmyIGGCC3ApaI，BanII，BmyI，AspHITGCA3NsiI，AspHI，BmyI，PstIGCGC3HaeII，BbeI29二、基因工程操作中

33、的其他酶二、基因工程操作中的其他酶（一）、（一）、DNA連接酶連接酶（二）、（二）、DNA聚合酶聚合酶I（三）、堿性磷酸酯酶（三）、堿性磷酸酯酶（四）、（四）、T4多聚核核苷酸激酶多聚核核苷酸激酶（五）、（五）、S1核酸酶核酸酶（六）、反向轉錄酶（六）、反向轉錄酶30第三節第三節 目的基因制備目的基因制備n原核生物基因的分離多采用前法，而真核細胞基因的分離則采用后兩原核生物基因的分離多采用前法，而真核細胞基因的分離則采用后兩種方法。種方法。一、生物學方法一、生物學方法l原核生物中常用鳥槍射擊法或滔彈散射法（原核生物中常用鳥槍射擊法或滔彈散射法（shotgun cloning）來克隆）來克隆分離

34、基因。此法優點是：快速簡便、產物純度高，是真正的天然基因，分離基因。此法優點是：快速簡便、產物純度高，是真正的天然基因，兼有外顯子和內含子。兼有外顯子和內含子。 l另一種生物學方法是采用分子雜交手段。另一種生物學方法是采用分子雜交手段。1973年年，Shin和和Martin用分用分子雜交技術分離目的基因獲得成功。子雜交技術分離目的基因獲得成功。31二、化學合成法二、化學合成法化學合成一個循環有如下化學合成一個循環有如下4個步驟：個步驟：l整個合成反應歷程如圖整個合成反應歷程如圖2-3表示。表示。 圖圖2-3 固定化亞磷酸三酯法合成寡聚核苷酸固定化亞磷酸三酯法合成寡聚核苷酸32三、基因文庫法三、

35、基因文庫法n基因文庫（基因文庫（gene library）或稱為）或稱為DNA文庫，它是指用克隆方法將一文庫，它是指用克隆方法將一種生物全部基因組以重組體的方式長期保持在適當的宿主中。當需要種生物全部基因組以重組體的方式長期保持在適當的宿主中。當需要重組體重組體DNA某一片段時，便可以在此文庫中查找。基因文庫又稱為某一片段時，便可以在此文庫中查找。基因文庫又稱為cDNA文庫文庫34。cDNA文庫構建的步驟：文庫構建的步驟：l1.酶促合成法制取酶促合成法制取cDNAl2.從組織或細胞中制備總從組織或細胞中制備總RNA和和mRNAl3.合成合成cDNA第一條鏈第一條鏈33l其反應過程為圖其反應過程

36、為圖2-5的所示。的所示。圖圖2-5 合成合成cDNA第一鏈反應過程第一鏈反應過程34l4. cDNA第二條鏈的合成，其反應歷程如圖第二條鏈的合成，其反應歷程如圖2-6所示。所示。圖圖2-6 置換法合成置換法合成cDNA反應過程反應過程35四、四、PCR擴增法擴增法n1985年，美國年，美國Cetus公司的公司的Mullis等人開發成功的聚合酶等人開發成功的聚合酶鏈式反應（鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR ）技術，這一）技術，這一快速地擴增特異快速地擴增特異DNA片段系片段系統在分子生物學領域中是一項統在分子生物學領域中是一項重大的革新。重大的革新。 n其反

37、應歷程如圖其反應歷程如圖2-7所示。所示。圖圖2-7 PCR擴增技術基本原理擴增技術基本原理36第四節第四節 基因載體基因載體n目前，在基因工程中應用的基因載體主要是質粒、病毒和噬菌體，它目前，在基因工程中應用的基因載體主要是質粒、病毒和噬菌體，它們都能擔當無性繁殖載體。因為它們均符合作為載體應具備的下列條們都能擔當無性繁殖載體。因為它們均符合作為載體應具備的下列條件：件：n（1）本身是一個復制子，能自我復制；）本身是一個復制子，能自我復制；n（2）相對分子質量較小，）相對分子質量較小， n（3）能給宿主細胞（受體細胞）提供可選擇標記）能給宿主細胞（受體細胞）提供可選擇標記 n（4）只有單一限

38、制性內切酶切點）只有單一限制性內切酶切點一、質一、質 粒粒l質粒（質粒（plasmid）存在于細菌、放線菌及酵母細胞內細胞質中雙螺旋）存在于細菌、放線菌及酵母細胞內細胞質中雙螺旋共價閉環的共價閉環的DNA（covalently,closed and circular DNA,縮寫為縮寫為cccDNA）。它能進行獨立復制并保持恒定遺傳的復制子。）。它能進行獨立復制并保持恒定遺傳的復制子。 37（一）質粒載體（一）質粒載體pBR322npBR322是目前應用最廣泛的人工構建的載體之一。如圖是目前應用最廣泛的人工構建的載體之一。如圖2-8所示所示5。用小寫英文字母用小寫英文字母P代表質粒，代表質粒，

39、BR表示該質粒表示該質粒 研究者研究者Bolivar 和和Rogigerus，而，而322是具體研究編號。是具體研究編號。pBR322大小為大小為4363bp，（，（1bp=1堿基對）含有堿基對）含有2個抗生素抗性基因個抗生素抗性基因 。npBR322質粒具有抗菌素抗性基因質粒具有抗菌素抗性基因 ，構建的，構建的pBR325、pBR327如圖如圖2-9、圖圖2-10所示。所示。 圖圖2-9 pBR325衍生質粒衍生質粒 圖圖2-10 pBR327衍生質粒衍生質粒38（二）質粒載體（二）質粒載體PUCnpUC質粒是在質粒是在pBR322的基礎上，在的基礎上，在未端加入一段多克隆位點未端加入一段多

40、克隆位點（multiple cloning sites,MCS）的）的LacZ基因。基因。二、二、噬菌體噬菌體l噬菌體（噬菌體（Phage）是病毒的一種，形態微小，只能在電子顯微鏡下才）是病毒的一種，形態微小，只能在電子顯微鏡下才能觀察到。能觀察到。 三、三、M13噬菌體噬菌體四、病毒四、病毒39第五節第五節 基因重組基因重組n基因重組即將目的基因（或外源基因）與載體在體外結合構建形成重基因重組即將目的基因（或外源基因）與載體在體外結合構建形成重組子。組子。 圖圖2-11 DNA體外重組方式體外重組方式 40第六節第六節 轉化、增殖和表達轉化、增殖和表達一、轉化一、轉化1、宿主細胞、宿主細胞2

41、、感受態、感受態3、擴增檢篩、擴增檢篩 R.K.Saiki和和K.B.Mullis分別于分別于1985年和年和1987年發展了一種年發展了一種“多聚酶多聚酶鏈反應（鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）” 。 PCR技術操作步驟為：技術操作步驟為：反復將目的基因片段進行熱變性處理，反復將目的基因片段進行熱變性處理，令其雙股鏈解開；令其雙股鏈解開；進行反鏈雜交、退火、形成單鏈；進行反鏈雜交、退火、形成單鏈；用用Taq DNA多聚酶沿多聚酶沿DNA鏈全程全成出兩股雙鏈鏈全程全成出兩股雙鏈DNA分子；分子；然后開始第二個然后開始第二個反應周期反應周期 。41二、基因表達

42、二、基因表達 克隆克隆DNA的最終目的是表達最終目的產物。因此，通過的最終目的是表達最終目的產物。因此，通過DNA重重組技術使特定基因片段在受體細胞內大量增殖，拷貝數目大大增加，組技術使特定基因片段在受體細胞內大量增殖，拷貝數目大大增加，就必須使特點基因進一步轉錄、翻譯為相應的蛋白質（或酶），進而就必須使特點基因進一步轉錄、翻譯為相應的蛋白質（或酶），進而獲得它們的代謝產物，這一過程稱為基因表達。獲得它們的代謝產物，這一過程稱為基因表達。 第七節第七節 基因工程在食品工業中應用基因工程在食品工業中應用一、轉基因微生物食品一、轉基因微生物食品轉基因微生物菌株則稱為工程菌（轉基因微生物菌株則稱為工

43、程菌（engineering strain）。）。 42（一）應用于提高食品產品的品質（一）應用于提高食品產品的品質第 一 個 采 用 基 因 工 程 改 造 的 食 品 微 生 物 為 面 包 酵 母第 一 個 采 用 基 因 工 程 改 造 的 食 品 微 生 物 為 面 包 酵 母（saccharomyces cerevisiae）。）。 1991年，英國政府批準通過了年，英國政府批準通過了DNA重重組面包酵母工程菌的商業化應用組面包酵母工程菌的商業化應用7。在啤酒釀造中。在啤酒釀造中一乙酰乳酸通過一乙酰乳酸通過自發氧化作用形成雙乙酰，雙乙酰形成機理及其基因重組控制雙乙酰自發氧化作用形成

44、雙乙酰，雙乙酰形成機理及其基因重組控制雙乙酰如圖如圖2-12、圖、圖2-13所示。所示。圖圖2-12 啤酒釀造中雙乙酰形成機理啤酒釀造中雙乙酰形成機理圖圖2-13 啤酒酵母導入啤酒酵母導入-乙酰乳酸脫羧酶基因后雙乙酰酶促轉化乙酰乳酸脫羧酶基因后雙乙酰酶促轉化43（二）應用于簡化工藝，縮短生產周期（二）應用于簡化工藝，縮短生產周期近年來，在一個啤酒酵母菌株中表達了一個內源性的近年來，在一個啤酒酵母菌株中表達了一個內源性的PGUI基因，結果基因，結果發現這個重組菌株能夠分泌有活性的內聚半乳糖酸酶，可以大大縮短葡萄酒發現這個重組菌株能夠分泌有活性的內聚半乳糖酸酶，可以大大縮短葡萄酒的過濾時間。的過濾

45、時間。 （三）應用于食品的抗菌和防腐保鮮（三）應用于食品的抗菌和防腐保鮮現將工程菌在食品工業應用較多的菌株如列表現將工程菌在食品工業應用較多的菌株如列表2-4所示。所示。 表表2-4 基因工程改良的微生物工程菌基因工程改良的微生物工程菌44（四）應用于食品級酶制劑生產菌的改良（四）應用于食品級酶制劑生產菌的改良 凝乳酶（凝乳酶（chymosin）是第一個應用基因工程技術把小牛胃中的）是第一個應用基因工程技術把小牛胃中的凝乳酶基因轉移至細菌或真核微生物生產的一種酶。凝乳酶基因轉移至細菌或真核微生物生產的一種酶。 現將現將NovoNordisk、Gist-Brocades等公司采用基因工程改良霉菌

46、等公司采用基因工程改良霉菌種列于表種列于表2-5、表、表2-6、表、表2-7。 45表表2-5 丹麥丹麥Novo Nordisk公司利用基因工程改良產酶微生物菌種公司利用基因工程改良產酶微生物菌種124647（5）應用于生產保健食品的有效成分）應用于生產保健食品的有效成分n現在，可以采用轉基因手段，在動、植物或其細胞中，得到基因表達現在，可以采用轉基因手段，在動、植物或其細胞中，得到基因表達而制造有益于人類健康的保健成分或有效因子。采用基因重組構建軍而制造有益于人類健康的保健成分或有效因子。采用基因重組構建軍一株高表達的單鏈蛋白一株高表達的單鏈蛋白2.5-DKG還原酶，以加速催化生成維生素還原

47、酶，以加速催化生成維生素C的的前體前體2-KLG，便可有效地縮短生產維生素，便可有效地縮短生產維生素C的生產周期。的生產周期。 n超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）能有效消除氧自由基，）能有效消除氧自由基， Brehm等人將等人將BStearothermophilus的的Mn-SOD基因克隆入大腸桿菌中，其重組體基因克隆入大腸桿菌中，其重組體Mn-SOD在大腸桿菌高效達，產生的在大腸桿菌高效達，產生的SOD占可溶性蛋白占可溶性蛋白49%。采用基。采用基因重組技術克隆破囊壺菌（因重組技術克隆破囊壺菌（Thraustochy triumroseum）DHA合成關合成關鍵酶基因，進而在酵母真核

48、細胞中表達。鍵酶基因，進而在酵母真核細胞中表達。Anammartet14克隆了畢氏克隆了畢氏酵母酵母9脂肪酸脫飽和酶基因及其調節機制。脂肪酸脫飽和酶基因及其調節機制。48（6）應用于食品微生物快速檢測）應用于食品微生物快速檢測n隨著隨著DNA分子檢測技術和分子檢測技術和PCR等技術的應用，可使沙門氏菌、李斯等技術的應用，可使沙門氏菌、李斯特氏菌、致瀉性特氏菌、致瀉性E.coli等食源性微生物的檢測已發展到一個新水平。等食源性微生物的檢測已發展到一個新水平。 二、轉基因動物食品二、轉基因動物食品l轉基因動物食品是由轉基因動物產生的食物或利用轉基因動物為原料轉基因動物食品是由轉基因動物產生的食物或

49、利用轉基因動物為原料生產的食品或食品添加劑。生產的食品或食品添加劑。 1985年，第一例轉基因家畜研制成功由于年，第一例轉基因家畜研制成功由于轉基因家禽及其生產的食品是人類較直接的食物，基因重組技術改進轉基因家禽及其生產的食品是人類較直接的食物，基因重組技術改進牛奶成分如表牛奶成分如表2-8所示。所示。 49表表2-8 基因重組技術改進牛奶成分基因重組技術改進牛奶成分1850三、轉基因植物食品三、轉基因植物食品n所謂轉基因植物食品是指由轉基因植物產所謂轉基因植物食品是指由轉基因植物產生的食物或利用轉基因植物為原料生產的生的食物或利用轉基因植物為原料生產的食品或食品添加劑。食品或食品添加劑。19

50、83年，世界上第一年，世界上第一例轉基因植物即轉抗蟲基因的煙草問世。例轉基因植物即轉抗蟲基因的煙草問世。1994年美國年美國FDA批準延熟保鮮的轉基因番批準延熟保鮮的轉基因番茄上市。茄上市。 nTi質粒是誘導植物腫瘤的質粒。依據質粒是誘導植物腫瘤的質粒。依據T區攜區攜帶基因功能，可決定植物冠癭瘤的形成和帶基因功能，可決定植物冠癭瘤的形成和控制冠癭堿的合成。控制冠癭堿的合成。Ti質粒結構中的可轉質粒結構中的可轉移移DNA（T-DNA）復促進）復促進Ti質粒轉移至植質粒轉移至植物細胞物細胞Ch-DNA中。其基因重組和轉移過中。其基因重組和轉移過程如圖程如圖2-15所示。所示。圖圖2-15 利用利用

51、Ti質粒將外源基因轉導入植物組織示意圖質粒將外源基因轉導入植物組織示意圖251n至目前為上，在歐洲根據相關法規（至目前為上，在歐洲根據相關法規（90/220EEC）已有）已有10多種轉基因多種轉基因植物（作物）被批準上市，如表植物（作物）被批準上市，如表2-9所示。在世界上有所示。在世界上有23個作物品系個作物品系已準許進行種植和飼料使用，延遲成熟番茄（表已準許進行種植和飼料使用，延遲成熟番茄（表2-10）以及改變脂肪）以及改變脂肪含量的轉基因作物（如表含量的轉基因作物（如表2-11）也已在某些國家準予種植。）也已在某些國家準予種植。表表2-9 歐洲獲準上市的轉基因作物及其產品歐洲獲準上市的轉

52、基因作物及其產品1852表表2-10 世界各地種植的延遲成熟番茄及其產品世界各地種植的延遲成熟番茄及其產品18l注：注：MFA改變脂肪酸含量（改變脂肪酸含量（GmFad2-1 為為-12-去飽和酶基因；去飽和酶基因；BayTE為硫脂酶基因，源自海灣月桂樹為硫脂酶基因，源自海灣月桂樹Umbellaria californica）；）；ABR抗抗生素（抗抗生素（bla為氨芐青霉素耐藥性基因，為氨芐青霉素耐藥性基因，npt卡那霉素耐藥性基因）；卡那霉素耐藥性基因）；RP報告基因報告基因（gus為為-葡糖醛酸酶基因）。葡糖醛酸酶基因）。53l目前，我國獲得安全證書的轉基因作物（如表目前，我國獲得安全證

53、書的轉基因作物（如表2-12）和已發放安全證）和已發放安全證書的進口轉基因產品見表書的進口轉基因產品見表2-13。表表2-12 我國獲得安全證書的轉基因作物我國獲得安全證書的轉基因作物19545556表表2-13我國已發放安全證書的進口轉基因產品我國已發放安全證書的進口轉基因產品1957四、食品與基因工程產業化四、食品與基因工程產業化n工程菌皺胃酶應用于干酪生產產業化工程菌皺胃酶應用于干酪生產產業化 n干酪是用皺胃酶或胃蛋白酶將原料乳凝聚，然后將凝塊進行加工、成干酪是用皺胃酶或胃蛋白酶將原料乳凝聚，然后將凝塊進行加工、成型或發酵成熟而制成的富有營養價值的乳制品干酪（型或發酵成熟而制成的富有營養

54、價值的乳制品干酪（cheese）。）。（一）干酪制造工藝流程（一）干酪制造工藝流程58第八節第八節 后基因組學及其應用研究后基因組學及其應用研究一、后基因組學涵義一、后基因組學涵義l所謂后基因組學（所謂后基因組學（post-genomics）是指包括基因組學（）是指包括基因組學（genomis）、）、蛋白質組學（蛋白質組學（proteomics）、代謝組學（）、代謝組學（metabotomics）和生物信息）和生物信息學（學（bio-informatics）等主要內容。）等主要內容。 二、后基因組學的應用研究二、后基因組學的應用研究l1.腫瘤及癌癥的發生均與細胞中染色體腫瘤及癌癥的發生均與細胞

55、中染色體DNA結構的變化密切相關。結構的變化密切相關。 l2.全面探索食品營養功能全面探索食品營養功能2122l3.利用哺乳動物及禽畜作為利用哺乳動物及禽畜作為“生物工廠生物工廠”提供人類優質食品提供人類優質食品59課程論文：n基因工程與食品基因工程與食品n1、概念清晰、概念清晰n2、基因工程研究內容和作用、基因工程研究內容和作用n3、基因工程在食品中應用的優勢方面。、基因工程在食品中應用的優勢方面。n4、你對基因工程的認識、你對基因工程的認識60第三章第三章 食品與蛋白質工程食品與蛋白質工程n第一節第一節 概述概述n第二節第二節 理性分子設計和定位突變技術理性分子設計和定位突變技術n第三節第

56、三節 體外定向進化體外定向進化n第四節第四節 融合蛋白技術融合蛋白技術n第五節第五節 食物蛋白質改性技術食物蛋白質改性技術61第一節第一節 概述概述一、蛋白質工程的涵義一、蛋白質工程的涵義l蛋白質工程是指以蛋白質的結構及其功能關系為基礎，通過基因修飾、蛋白質工程是指以蛋白質的結構及其功能關系為基礎，通過基因修飾、蛋白質修飾等分子設計，對現存蛋白質加以改造，組建新型蛋白質的蛋白質修飾等分子設計，對現存蛋白質加以改造，組建新型蛋白質的現代生物技術。現代生物技術。 l理性設計是在蛋白質天然結構的基礎上進行修飾改造，但是，產生一理性設計是在蛋白質天然結構的基礎上進行修飾改造，但是，產生一個結構確定、具

57、有新功能特性蛋白質并不容易，無法滿足對現有蛋白個結構確定、具有新功能特性蛋白質并不容易，無法滿足對現有蛋白質進行分子改良的要求。質進行分子改良的要求。62二、理性分子設計和非理性分子設計二、理性分子設計和非理性分子設計n所謂非理性設計或定向進化就是在不清楚蛋白質三維結構信息和作用機制的所謂非理性設計或定向進化就是在不清楚蛋白質三維結構信息和作用機制的情況下，在實驗室條件下模擬自然進化的過程（隨機突變、重組和選擇），情況下，在實驗室條件下模擬自然進化的過程（隨機突變、重組和選擇），在一定條件下使基因發生大量變異，然后通過多輪高通量的篩選方法定向選在一定條件下使基因發生大量變異，然后通過多輪高通量

58、的篩選方法定向選擇出所需要的特性突變物，在較短時間內完成漫長的自然進化過程，得到具擇出所需要的特性突變物，在較短時間內完成漫長的自然進化過程，得到具有特性預期的新蛋白質的一種蛋白質工程技術。非理性設計的主要技術包括有特性預期的新蛋白質的一種蛋白質工程技術。非理性設計的主要技術包括定向進化定向進化(directed evolution) 、DNA 改組改組 (gene shuffling)及融合蛋白及融合蛋白 (fusions of proteins)技術等。技術等。 63三、蛋白質工程在食品工業中的應用三、蛋白質工程在食品工業中的應用n蛋白質工程在食品工業中應用主要集中在食品工業專用酶制劑的改

59、造蛋白質工程在食品工業中應用主要集中在食品工業專用酶制劑的改造方面。通過酶結構或局部構象的調整和改造，方面。通過酶結構或局部構象的調整和改造， 可大大提高食品專用可大大提高食品專用酶制劑的耐高溫、抗氧化能力，增加酶的穩定性和適用酶制劑的耐高溫、抗氧化能力，增加酶的穩定性和適用pH 范圍，從范圍，從而獲得性質更穩定、作用效率更高的酶。而獲得性質更穩定、作用效率更高的酶。第二節第二節 理性分子設計和定位突變技術理性分子設計和定位突變技術一、蛋白質理性分子設計的基本步驟一、蛋白質理性分子設計的基本步驟l基于天然蛋白質結構的理性分子設計過程基本分為以下步驟，如圖基于天然蛋白質結構的理性分子設計過程基本

60、分為以下步驟，如圖3-1所示。所示。l表表3-1列出了蛋白質設計的目標及解決辦法列出了蛋白質設計的目標及解決辦法 64蛋白質幾何優化結構比對分析天然蛋白質蛋白質晶體學蛋白質結構預測蛋白質三維結構結構與功能關系突變體設計預測合成定位突變從數據庫輸入分離純化與表征新蛋白質圖圖3-1 蛋白質理性分子設計流程圖蛋白質理性分子設計流程圖65表表3-1 蛋白質設計的目標及解決辦法蛋白質設計的目標及解決辦法 66l表表3-2列出了目前蛋白質設計所涉及的計算工具及軟件。列出了目前蛋白質設計所涉及的計算工具及軟件。表表3-2 蛋白質分子設計的技術工具及網址蛋白質分子設計的技術工具及網址67二、定位突變二、定位突