1、惡性腫瘤組織微衛惡性腫瘤組織微衛不穩定性的研究不穩定性的研究微衛星微衛星(microsatellite,MS),(microsatellite,MS),是指是指DNADNA基因組中小于基因組中小于1010個核苷酸的簡單重復序列個核苷酸的簡單重復序列, , 又稱短串聯重復又稱短串聯重復(short (short tandem repeat, STR)tandem repeat, STR)，是，是一種遍布于人類基因組的一種遍布于人類基因組的重復序列，一般為重復序列，一般為2 26 6個個堿基重復，如堿基重復，如(CA)n(CA)n、(GT)n(GT)n、(CAG)n(CAG)n等，尤以等，尤以(C

2、A)n(CA)n重復序列最為常見。重復序列最為常見。其長度由重復單位的拷貝數其長度由重復單位的拷貝數決定，是一類呈高度多態的決定，是一類呈高度多態的遺傳標記，不僅可用于基因遺傳標記，不僅可用于基因組遺傳連鎖圖的構建以及基組遺傳連鎖圖的構建以及基因的定位與克隆，而且可用因的定位與克隆，而且可用于遺傳性疾病的連鎖分析和于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷。基因診斷。遺傳物質的突變是導致人類許多疾病(包括腫瘤)的主要原因,而引起遺傳物質突變的直接誘因是不同類型的DNA損傷。其中多種原因造成的DNA雙鏈分子的堿基錯配是導致突變的主要DNA損傷類型之一。大量研究表明,從細菌、酵母到人體細胞都存在一種能修復D

3、NA堿基錯配的安全保障體系, 這種保障體系是由一系列特異性修復DNA堿基錯配的酶分子組成,被稱為DNA錯配修復系統(DNA mismatch repair system,MMR)。人體細胞中由于MMR系統的存在,可保持遺傳物質的完整性和穩定性,避免遺傳物質突變的產生,保證DNA復制的高保真度。微衛星不穩定性(microsatellite instability,MSI)是指由于復制錯誤(replication error, RER)引起的簡單重復序列的增加或丟失,也稱RER陽性或RER表型。1993年，Altonen等首次發現，在HNPCC細胞中存在高頻率的MSI后，又有很多學者在多種腫瘤中發

4、現MSI。MSI作為腫瘤遺傳不穩定一個敏感的檢測指標已逐漸被大家接受。在以后的研究中，相繼在肺在以后的研究中，相繼在肺癌，胃癌，白血病等其它腫癌，胃癌，白血病等其它腫瘤也發現微衛星不穩定性。瘤也發現微衛星不穩定性。Li Li等報道一組等報道一組100100例包括頭頸部例包括頭頸部腫瘤，膀胱腫瘤及肺癌病例，腫瘤，膀胱腫瘤及肺癌病例，用用9 9個微衛星位點標記物篩選，個微衛星位點標記物篩選，發現發現3 3個及個及4 4個核苷酸重復序個核苷酸重復序列更易出現插入或缺失，列更易出現插入或缺失，2626例出現至少一個位點的改變。例出現至少一個位點的改變。 顯示微衛星不穩定性改變可作為腫瘤細胞的克隆標志，

5、運用于腫瘤的檢測。腫瘤常在抑癌基因位點出現染色體基因缺失，表現為等位基因雜合性丟失(Loss of heterozygosity),通過檢測分析腫瘤雜合性丟失及其規律，可在染色體一定范圍內發現腫瘤的抑癌基因及易感基因。目前已發現RER+腫瘤主要有3類：一類為散發性結直腸癌,這一類腫瘤細胞核型為近二倍體,病人預后較好；另一類為HNPCC病人發生的結直腸癌、子宮內膜癌以及卵巢癌,這一類腫瘤幾乎都表現為MSI,與散發性結直腸癌比較,發病年齡較早；第三類為包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在內的其它腫瘤,這一類腫瘤MSI發生頻率相對較低。 近年來研究證實RER+是HNPCC、肺癌、乳腺癌、食管癌、膀胱癌的早期分

6、子標志,也是慢性髓細胞性白血病的晚期分子標志,對腎母細胞瘤來說,不僅是晚期分子標志并與其惡性程度有關,對胃癌來說,不僅是其早期事件,而且與癌的惡性轉移有一定聯系。并發現MSI存在于病理證實為陰性的腫瘤旁切緣組織。目前已經知道,RER+大腸癌有以下特性；(1)發病年齡早,35歲以下大腸癌患者RER陽性比例最高；(2)多位于右半結腸,易發生腸內或腸外其它器官的多發性腫瘤,多發性腫瘤RER陽性率(80%)明顯高于單發性腫瘤(11%), 術后易再發其它原發惡性腫瘤；(3)DNA多為二倍體或近二倍體；(4)對某些化療藥物(如順鉑)有原發耐藥性；(5)具有高突變特性,許多癌基因及抑癌基因(如RAS,p53

7、,APC等)突變數目明顯增多； (6)粘液腺癌多見,組織分化差,多浸潤生長,腫塊較大,但較少發生淋巴結轉移,預后較好,而RER-的大腸癌多發生在左半結腸,多為多倍體。晚期胃癌、遠端胃癌多為RER+,RER+表型在腸型和實體瘤中的頻率顯著高于印戒細胞癌；近端胃癌早期多為RER-。 這說明與RER+癌發病機制不同。因此,檢測不同腫瘤的MSI,對深入認識腫瘤病的基因變化是十分有幫助的。目前,需大力開展對人體多種腫瘤MSI的檢測,了解各種腫瘤與MMR基因突變的關系,弄清腫瘤中MMR基因的突變類型及作用方式,建立更為簡便的基因突變的檢查技術并應用了臨床。微衛星不穩定性的研究方法，目前主要以PCR技術為基

8、礎研究微衛星不穩定性改變，步驟為：(1)首先需確定特定染色體上特定微衛星位點標記，并根據其序列合成特異性引物。引物序列一般可根據特定位點直接從基因庫中查詢。（2）收集腫瘤組織及相應正常組織標本，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，提取基因組DNA。 （3）PCR擴增。（4）擴增產物的檢測。常用凝膠電泳，溴化乙錠染色后在紫外燈下觀察，或放射自顯影及銀染等方法觀察。（5）判斷結果。若腫瘤組織較正常對照組織出現某一基因條帶消失或密度減少50以上，可判斷為雜和性丟失；若腫瘤組織出現基因條帶的增多，即判斷為不穩定性改變。存在的問題：通過對人體多種腫瘤MSI的檢測,目前已初步對體細胞中MMR系統的功能以及MMR缺陷與

9、腫瘤發生的相應關系有所認識,但此僅僅是深入研究的開始而已,因為(1)人類MMR基因不僅具有識別和修復DNA復制過程中出現的DNA錯配的功能,有實驗報道, 該組基因還以某種方式參與細胞對增殖的調控,其確切機理及調節方式有待進一步研究。(2)大腸桿菌MutHLS系統中的MMR基因僅占大腸桿菌基因組中突變控制位點(murator loci)的一半。除MMR基因外,其余占半數的突變控制位點的基因組成了大腸桿菌細胞中的對突變產生具有明顯抑制作用的體系。 由于細菌與人體細胞在由于細菌與人體細胞在MMRMMR系系統上表現出極大的相似性統上表現出極大的相似性, ,因而因而推測人體細胞除推測人體細胞除MMRMMR系統外系統外, ,也也應含有類似于大腸桿菌的其它應含有類似于大腸桿菌的其它突變抑制系統突變抑制系統, ,該突變抑制系統該突變抑制系統也應該在維持人基因組穩定性也應該在維持人基因組穩定性上發揮重要作用上發揮重要作用, ,其功能失活也其功能失活也參與了腫瘤的形成。目前參與了腫瘤的形成。目前, ,對人對人體細胞中可能存在的此系統還體細胞中可能存在的