1、USTB時國慶時國慶應用科學學院生物科學與技術系應用科學學院生物科學與技術系泛素泛素-蛋白酶體途徑與惡性腫瘤蛋白酶體途徑與惡性腫瘤 USTB主要內容主要內容泛素泛素- -蛋白酶體途徑蛋白酶體途徑1泛素泛素蛋白酶體途徑與蛋白酶體途徑與癌癥癌癥發生發生2蛋白酶體作為抗腫瘤藥物靶標蛋白酶體作為抗腫瘤藥物靶標3問題與展望問題與展望4USTB一、泛素一、泛素- -蛋白酶體途徑蛋白酶體途徑蛋白質合成蛋白質合成蛋白質降解蛋白質降解USTBAaron CiechanoverAvram Hershko Irwin Rose 2004年年,因因“發現泛素介導的蛋白質降解途徑發現泛素介導的蛋白質降解途徑”，來自以色

2、列，來自以色列工學院的工學院的Aaron Ciechanover、 Avram Hershko和美國加利和美國加利福尼亞大學歐文分校的福尼亞大學歐文分校的 Irwin Rose分享了諾貝爾化學獎。分享了諾貝爾化學獎。 USTB哺乳動物細胞中蛋白質的降解哺乳動物細胞中蛋白質的降解異常蛋白異常蛋白短周期蛋白短周期蛋白內質網相關內質網相關蛋白蛋白長周期蛋白長周期蛋白膜蛋白膜蛋白細胞外蛋白細胞外蛋白泛素泛素- -蛋白酶體途徑蛋白酶體途徑溶酶體途徑溶酶體途徑氨基酸氨基酸小肽小肽80-90%80-90%10-20%10-20%USTB泛素泛素- -蛋白酶體途徑在細胞分化、細胞繁殖、細胞凋亡、基蛋白酶體途徑

3、在細胞分化、細胞繁殖、細胞凋亡、基因轉錄、信號傳導、代謝調控、免疫監視等基本細胞生命過因轉錄、信號傳導、代謝調控、免疫監視等基本細胞生命過程中起關鍵作用。程中起關鍵作用。USTB泛素泛素- -蛋白酶體途徑蛋白酶體途徑 （Ubiquitin-Proteasome PathwayUbiquitin-Proteasome Pathway，UPPUPP）蛋白質降解蛋白質降解去泛素化去泛素化泛素活化泛素活化泛素結合泛素結合26S 26S 蛋白酶體蛋白酶體小肽小肽泛素泛素目標蛋白目標蛋白DUBsUSTB泛素泛素v 泛素是1975 年由Goldstein 首先發現的一種在真核生物細胞內高度保守的多肽，單個泛

4、素分子由76 個氨基酸組成，分子量約8. 5 kD。泛素分子緊密折疊成球形，5 股混合的 片層形成一個腔樣結構。內部對角線位置有1 個 螺旋，這個結構稱為泛素折疊。這個小蛋白含有一個明顯的疏水核心和大量的氫鍵，表現出特殊的穩定性，能夠防止在結合和靶向性降解循環中變性失活，從而保證泛素循環的運行。從泛素折疊中突出來的是具有一定變形性的C末端延伸部分，這個末端第76 位含有一個必須的甘氨酸。泛素與其它蛋白都是通過C-末端第76 位甘氨酸來連接的。MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG

5、USTB泛素活化酶（泛素活化酶（E1）vE1 是泛素與底物蛋白結合所需要的第一個酶。E1 是一種廣泛表達的多肽，大約1100 個氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸殘基。E1 有2 個亞型，是由同一個mRNA 在不同的起始位點翻譯而成的，存在于細胞漿和細胞核中。酵母的E1 基因失活后是致命的，說明這個蛋白對于細胞的生存是至關重要的。E1 可以水解ATP，與泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素。E1 具有高度的催化效能，在低濃度的情況下就能夠激活泛素，滿足下游的級聯反應過程。USTB泛素結合酶（泛素結合酶（E2s）v 級聯反應的第二步是泛素分子經過轉硫醇反應從E1 半胱氨酸殘基轉移給E2s 活

6、化的半胱氨酸位點。E2s 在哺乳動物中至少有25 個基因，所有的E2s 都含有一個保守的大約150 個氨基酸的核心結構域，在結構域的中央是決定E2s 活性的半胱氨酸殘基，位于蛋白表面淺的裂隙內。E2s 家族中的一小部分成員只含有這個核心結構，但是其它的大部分成員還有N-或C-末端的延伸，這種結構可能與E3s 的識別、E2s 自身的活性以及底物識別有關。E1 和E3s 通過相同的基序與E2s 連接，這說明在反應循環過程中，E2s 必須在E1和E3s 之間穿梭往返運行。因此為了保證在激活的泛素與數量巨大的E3s 之間得到平衡的分布，需要多個E2s 異構體。E2s / Ub 非共價結合的親和力非常低

7、，說明其在轉移泛素分子到靶蛋白上起著重要的作用。USTB泛素泛素-蛋白連接酶（蛋白連接酶（E3s）v泛素化途徑最重要的特征就是底物的多樣性和選擇性，這一功能由E3s 直接決定。目前主要有3種類型的E3s，即含有HECT（ homologous to E6- associatedprotein carboxyl terminus）結構域的E3s、含有環指狀（RING finger）結構域的E3s 和含有U-box結構域的E3s。在高等生物E3 的總數從幾百到一千以上，新的E3 亞家族仍不斷被發現。正是由于這些復雜多變的E3s 家族成員可以對不同的底物進行特異性的識別，才呈現出蛋白降解的高度選擇性

8、。USTB泛素解離酶（泛素解離酶（DUBs）vDUBs 屬于蛋白酶超家族，根據其催化機制，可以分為5 類（天門冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶），生物信息學研究顯示大約有79 個有功能的DUBs，其中大部分為半胱氨酸蛋白酶。DUBs 能夠識別最接近的泛素基序，特異性地在泛素和與其C 末端最后一個殘基（Gly76）相連的分子之間斷開。USTB26S 蛋白酶體蛋白酶體v 26S 蛋白酶體是降解泛素化底物的一個ATP 依賴型蛋白水解復合體，由20S 核心蛋白酶（core protease，CP）和19S 調節顆粒（regulatory particle，RP）構成

9、。CP 是由4 個七聚體蛋白組成的環層疊在一起形成的一個空心圓柱體樣結構（1-71-71-71-7），是26S 蛋白酶體的水解核心。活性位點位于20S 圓柱體空心結構中心的2 個 環上。2 個亞基的氨基末端封住蛋白水解腔隙的入口，對蛋白酶體CP 的活性具有自身抑制作用，這樣只有進入蛋白酶體圓柱體內部的蛋白才能夠被水解。RP 由基底（Base）和蓋子（ Lid）兩個亞單位組成，分別與CP 兩端的 環相結合。基底亞單位是由6 個相關的AAA-ATPases RPT1-6（regulatory particle triple-Aprotein）和3 個non-ATPase RPN（ regulato

10、ry particlenon-ATPase）1、2 和10 組成的環狀結構，能夠活化20S 核心顆粒。蓋子亞單位含有其余的non-ATPase（RPN 3、5-9、11 和12），是泛素依賴性蛋白降解所必須的。USTB蛋白酶體結構蛋白酶體結構26S 蛋白酶體包括蛋白酶體包括2個個19S調控調控蛋白和一個蛋白和一個20S核心蛋白核心蛋白USTB20S 20S 蛋白酶體至少有三種不同的蛋白酶活性蛋白酶體至少有三種不同的蛋白酶活性已知的已知的20S 蛋白酶體蛋白酶蛋白酶體蛋白酶活性至少有三種，催化位點活性至少有三種，催化位點均位于均位于亞基上，分別是：亞基上，分別是：類糜蛋白酶活性（類糜蛋白酶活性（

11、5），），類胰蛋白酶活性（類胰蛋白酶活性（2），），肽肽-谷氨酰肽水解酶活性（谷氨酰肽水解酶活性（1） USTB1、2、 3亞基對多肽的水解依靠亞基對多肽的水解依靠Thr1USTB二、泛素二、泛素- -蛋白酶體途徑（蛋白酶體途徑（UPPUPP）與癌癥發生）與癌癥發生vUPP調控細胞周期與癌癥發生調控細胞周期與癌癥發生細胞周期包括：細胞周期包括：pG1G1期：第一個間期，主要進行細胞體期：第一個間期，主要進行細胞體積的增大積的增大, ,并為并為DNADNA合成作準備。不分裂合成作準備。不分裂細胞則停留在細胞則停留在G1 G1 期。期。pS S 期：期：DNA DNA 合成時期，染色體數目在合成時

12、期，染色體數目在此期加倍。此期加倍。 pG2G2期：期：DNA DNA 合成后至細胞分裂開始之合成后至細胞分裂開始之前的第二個間期，為細胞分裂作準備。前的第二個間期，為細胞分裂作準備。 pM M 期：細胞分裂期。期：細胞分裂期。pG0G0期：離開細胞周期不再進行分裂的期：離開細胞周期不再進行分裂的時期，也就是休息的時期。時期，也就是休息的時期。 USTB蛋白酶體對細胞周期的調控蛋白酶體對細胞周期的調控USTBv P27P27KIP1KIP1具有負反饋調節具有負反饋調節CDK2CDK2Cyclin ECyclin E和和CDK2CDK2Cyclin A Cyclin A 復合體的作用，阻止細胞周

13、期從復合體的作用，阻止細胞周期從G G期進入期進入S S期，從而起到抑期，從而起到抑制細胞生長的作用。制細胞生長的作用。v P27P27KIP1KIP1的表達受的表達受E3E3家族家族SCFSCF和后期促進復合物（和后期促進復合物（APC/CAPC/C）兩）兩種蛋白酶的調控。種蛋白酶的調控。v 在一些腫瘤中，在一些腫瘤中，SCFSCF的的Skp2Skp2亞基活性增加，從而使亞基活性增加，從而使p27p27KIP1KIP1發生過度泛素化，而被蛋白酶體降解。發生過度泛素化，而被蛋白酶體降解。v 由于由于p27p27KIP1KIP1的泛素化降解，下調了細胞內的的泛素化降解，下調了細胞內的p27p27

14、水平，使水平，使細胞增殖異常加快，這可能是導致細胞癌變的重要原因。細胞增殖異常加快，這可能是導致細胞癌變的重要原因。USTBvUPP調控細胞凋亡與癌癥發生調控細胞凋亡與癌癥發生v細胞凋亡（細胞凋亡（apoptosisapoptosis）是指細胞在一定的生理或病理）是指細胞在一定的生理或病理條件下，受內在遺傳機制的控制自動結束生命的過程。條件下，受內在遺傳機制的控制自動結束生命的過程。v細胞凋亡是生物界廣泛存在的一種基本生命現象，如同細胞凋亡是生物界廣泛存在的一種基本生命現象，如同細胞生長、發育、增殖一樣，起著十分重要的作用。細胞生長、發育、增殖一樣，起著十分重要的作用。vUPP通過通過26S蛋

15、白酶體降解一些與凋亡相關的蛋白，如蛋白酶體降解一些與凋亡相關的蛋白，如轉錄因子，凋亡前蛋白和抗凋亡蛋白等，發揮調控細胞轉錄因子，凋亡前蛋白和抗凋亡蛋白等，發揮調控細胞凋亡的作用。凋亡的作用。USTB2.1 UPP對對p53蛋白的調控蛋白的調控vp53蛋白是細胞內重要的凋亡蛋白是細胞內重要的凋亡調控因子，可通過激活一系列調控因子，可通過激活一系列靶基因實現凋亡調控功能。靶基因實現凋亡調控功能。vMDM2是是E3家族成員，促進家族成員，促進p53從核內向細胞質轉運，使從核內向細胞質轉運，使之被泛素化后降解，從而發揮之被泛素化后降解，從而發揮抗凋亡作用。抗凋亡作用。v多種腫瘤細胞中發現多種腫瘤細胞中

16、發現UPP活性活性上調，上調，p53蛋白降解增加，腫蛋白降解增加，腫瘤細胞增殖明顯上升。瘤細胞增殖明顯上升。USTB2.2 UPP對轉錄因子對轉錄因子NF-B的的調控調控v細胞轉錄因子細胞轉錄因子NF-B可以激活可以激活抗凋亡基因如抗凋亡基因如bcl-2等，發揮抗等，發揮抗凋亡作用凋亡作用 。v正常情況下，正常情況下， NF-B 活性被活性被IB抑制抑制 。v腫瘤細胞中參與腫瘤細胞中參與IB 降解的蛋降解的蛋白酶體活性增加，細胞內白酶體活性增加，細胞內NF-B 水平升高，細胞增殖增加。水平升高，細胞增殖增加。USTB三、蛋白酶體作為抗腫瘤藥物靶標三、蛋白酶體作為抗腫瘤藥物靶標1、為什么蛋白酶體

17、可以作為抗腫瘤藥物靶標？、為什么蛋白酶體可以作為抗腫瘤藥物靶標？v 大量實驗研究顯示，活躍增殖的惡性腫瘤細胞比正常細胞大量實驗研究顯示，活躍增殖的惡性腫瘤細胞比正常細胞對蛋白酶體抑制劑更加敏感。對蛋白酶體抑制劑更加敏感。Cell Death and Differentiation (1998) 5, 1062-1075USTBv 對第一個進入臨床實驗的藥物對第一個進入臨床實驗的藥物BortemibBortemib的毒理觀察顯示，的毒理觀察顯示，該藥物毒副作用是可控的。該藥物毒副作用是可控的。Annals of Oncology 17: 813817, 2006USTBv 腫瘤細胞對蛋白酶體抑制

18、敏感，而正常細胞不敏感的機理腫瘤細胞對蛋白酶體抑制敏感，而正常細胞不敏感的機理尚不清楚，目前猜測可能與如下因素有關：尚不清楚，目前猜測可能與如下因素有關：v 癌細胞處于快速的增殖中，并且存在一個或多個細胞周期癌細胞處于快速的增殖中，并且存在一個或多個細胞周期檢控點（檢控點（checkpoint）異常，這導致缺陷蛋白的積累速度）異常，這導致缺陷蛋白的積累速度高于正常細胞，因此更需要蛋白酶體作為一種蛋白降解途高于正常細胞，因此更需要蛋白酶體作為一種蛋白降解途徑。徑。v 蛋白酶體活性的抑制可以修復某些細胞周期及凋亡檢控點蛋白酶體活性的抑制可以修復某些細胞周期及凋亡檢控點的突變因子，使失控的細胞增殖被

19、抑制。的突變因子，使失控的細胞增殖被抑制。v 轉錄因子轉錄因子NF-B途徑的抑制途徑的抑制USTB三、蛋白酶體作為抗腫瘤藥物靶標三、蛋白酶體作為抗腫瘤藥物靶標2 2、作為抗腫瘤藥物的蛋白酶體抑制劑、作為抗腫瘤藥物的蛋白酶體抑制劑2.1 2.1 硼替佐米（硼替佐米（bortezomib,PS-341bortezomib,PS-341）是首個被美國是首個被美國FDAFDA批準批準用于臨床的蛋白酶體抑制劑，用于治療復發性、難治性用于臨床的蛋白酶體抑制劑，用于治療復發性、難治性多發性骨髓瘤。多發性骨髓瘤。v作用位點：特異性抑制蛋白酶體的類糜蛋白酶活性（作用位點：特異性抑制蛋白酶體的類糜蛋白酶活性（5亞

20、基亞基）。）。USTB硼替佐米臨床實驗結果USTB硼替佐米臨床實驗結果USTBJOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, 2005,23,230-239蛋白酶體抑制對骨髓瘤細胞及其微環境的影響USTB2.22.2、EGCGEGCG及其衍生物及其衍生物v (-)-EGCG(-)-EGCG是一種從綠茶中提取的天然多酚類化合物。是一種從綠茶中提取的天然多酚類化合物。DouDou等證明等證明(-)-EGCG(-)-EGCG可以抑制蛋白酶體的可以抑制蛋白酶體的1亞基和亞基和5亞基蛋白亞基蛋白酶活性。人工合成的含酯鍵的衍生物具有類似的抑制活性。酶活性。人工合成的含酯鍵的衍生物具有類似的抑制

21、活性。J Biol Chem 2001;276:1332213330.USTBv 將將EGCGEGCG與與5亞基進行分子對接（亞基進行分子對接（docking）,發現發現EGCG可可以很好的嵌入到以很好的嵌入到5亞基的活性位點。亞基的活性位點。PROTEINS， 54:5870 (2004)USTBv EGCG與與5亞基的結合可能來源于亞基的結合可能來源于2種作用：種作用：1）Thr1上的上的OH與與EGCG上的羰基上的羰基C形成半縮醛；形成半縮醛；2）EGCG的的AC環與環與5亞基的亞基的S1口袋有較強的疏水相互作用。口袋有較強的疏水相互作用。PROTEINS， 54:5870 (2004)

22、USTBv 為提高細胞對為提高細胞對EGCG的攝取及的攝取及EGCG在細胞中的穩定性，在細胞中的穩定性，對對EGCG的羥基進行了酰基化保護。的羥基進行了酰基化保護。Cancer Res 2007; 67: (9), 4303-4310USTBCancer Res 2007; 67: (9), 4303-4310USTBCancer Res 2007; 67: (9), 4303-4310USTB2.3、醉茄素A (withaferin-A)Mol Pharmacol 71:426437, 2007USTBMol Pharmacol 71:426437, 2007USTBMol Pharmaco

23、l 71:426437, 2007USTB2.42.4、金屬有機化合物、金屬有機化合物v 許多腫瘤細胞富含銅。許多腫瘤細胞富含銅。v 無毒的有機配體進入細無毒的有機配體進入細胞后與銅結合生成蛋白胞后與銅結合生成蛋白酶體抑制劑。酶體抑制劑。v 對腫瘤細胞更高的選擇對腫瘤細胞更高的選擇性性Breast Cancer Research 2005, 7:R897-R908USTBBreast Cancer Research 2005, 7:R897-R908CQ+Cu和和PDTC+Cu對對MCF10細胞凋亡的誘導。細胞凋亡的誘導。 （a）正常乳腺細）正常乳腺細胞胞MCF10A； （b）癌變前乳腺細胞）

24、癌變前乳腺細胞MCF10AT1K.cl2； （c）癌變）癌變乳腺細胞乳腺細胞MCF10DCIS.comUSTBBreast Cancer Research 2005, 7:R897-R908CQ+Cu和和PDTC+Cu對正常乳腺細胞對正常乳腺細胞MCF10A和癌變乳腺細胞和癌變乳腺細胞MCF10DCIS.com中蛋白酶體活性的影響。中蛋白酶體活性的影響。USTBBreast Cancer Research 2005, 7:R897-R908癌變前細胞癌變前細胞MCF10AT1K.cl2MCF10AT1K.cl2和乳腺癌細胞和乳腺癌細胞MCF-MDA-231MCF-MDA-231細胞均可富集與病人組織相細胞均可富集與病人組織相近濃度水平的近濃度水平的CuCu，并被，并被CQCQ和和PDTCPDTC誘導凋亡。誘導凋亡。USTBv 某些重金屬（某些重金屬（CdCd、CrCr、NiNi、PbPb等）在細胞中等）在細胞中的積累是導致細胞癌的積累是導致細胞癌變的重要原因。變的重要原因。v 用某種配體處理細胞，用某種配體處理細胞，使之與細胞內重金屬