1、實驗一實驗一 糖類的定量測定糖類的定量測定實驗二實驗二 紙層析法分析氨基酸紙層析法分析氨基酸實驗三實驗三 血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳實驗四實驗四 酵母酵母RNARNA的提取及含量測定的提取及含量測定實驗五實驗五 外界因素對酶活性的影響外界因素對酶活性的影響實驗六實驗六 蛋白質含量的測定蛋白質含量的測定實驗十四實驗十四 胰島素、腎上腺素對血糖濃度的影響胰島素、腎上腺素對血糖濃度的影響實驗七實驗七 去污劑對紅血球細胞膜穩定性的影響去污劑對紅血球細胞膜穩定性的影響實驗八實驗八 盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白實驗九實驗九 動物組織核糖核酸

2、的制備及測定動物組織核糖核酸的制備及測定實驗十實驗十 脲酶脲酶KmKm值的簡易測定值的簡易測定實驗十一實驗十一 粗脂肪提取粗脂肪提取實驗十二實驗十二 ATPATP的生物合成的生物合成實驗十三實驗十三 動物肝臟動物肝臟RNARNA的制備的制備( (苯酚法苯酚法) )和純度測定和純度測定圖31 醋酸纖維素薄膜規格及點樣位置示意圖 虛線處為點樣位置圖3一2 正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖 1為清蛋白；2，3，4，5分別為1-，2-，-及-球蛋白；6為點樣原點 此法由于操作簡單快速、分辨率高及重復性好等優點，目前已成為臨床生化檢驗的常規操作之一。它不僅可用于分離血清蛋白，還可用于分離脂蛋白、血紅蛋

3、白及同工酶的分離測定。實驗六實驗六 蛋白質含量的測定蛋白質含量的測定FolinFolin- -酚試劑法（酚試劑法（LowryLowry法）和考馬斯亮藍法法）和考馬斯亮藍法（BrodfordBrodford法）法） 一一 FolinFolin- -酚試劑法（酚試劑法（LowryLowry法）法）目的和要求目的和要求學習Folin-酚法測定蛋白質含量的原理和方法。進一步掌握分光光度法求標準曲線、準確測定未知樣品、正確使用儀器 原理原理蛋白質濃度可以從它們的物理化學性質，如折射率、比重、紫外吸收等測定而得知：或用化學方法，如定氮、雙縮脲反應、Folin-酚試劑反應等方法來求算。其中雙縮脲法和Foli

4、n-酚法是一般實驗室中經常使用的方法。它們操縱簡便、迅速，不需要復雜而昂貴的設備，又能適合一般實驗室的要求，若作一般的濃度測定較為適應。Folin-酚法靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。本實驗采用的是Folin-酚法。Folin-酚法所用的試劑由兩部分組成。試劑甲相當于雙縮脲試劑，可與蛋白質中的肽鍵起顯色反應。試劑乙（磷鎢酸和磷鉬酸混合液）在堿性條件下極不穩定，易被酚類化合物還原而呈藍色反應（鉬藍和鎢藍的混合物）。由于蛋白質中含有帶酚基的酪氨酸，故有此顏色反應。因此，用Folin-酚法測定蛋白質含量靈敏度較高。實驗步驟實驗步驟1.標準曲線的制作：按下表操作管 號BSA（300gmL）H2OPr

5、.含量g步 驟12345600.20.40.60.81.01.00.80.60.40.20050100150200250各試管加入試劑甲5.0mL，混合后放置10分鐘，加入試劑乙0.5mL，立即混合，37度恒溫反應20分鐘。以1號為參比，測A750的值。2. 樣品（小白菜）液的提取稱取小白菜1-4克（菜桿2-4克，菜葉1-2克）置于研缽中，加5mL蒸餾水在低溫下研磨成勻漿，全部轉移至50mL容量瓶中，并定容至刻度，然后抽濾，在3000rpm離心20分鐘，上層清液為提取液，待用。1.樣品的測定吸取提取液和稀釋250倍的血清液各1.0mL于試管中（三次重復），分別加5.0mL試劑甲，放置10分鐘后

6、，加試劑乙0.5mL，立即混勻，恒溫37度反應20分鐘，測A750的值。管 號小 白 菜T 或 A管 號血 清T 或 A123123小白菜用mgg，血清用mgmL。實驗七實驗七 去污劑對紅血球細胞膜穩定性的影響去污劑對紅血球細胞膜穩定性的影響目的和要求目的和要求了解各種去污劑對紅血球細胞膜穩定性的影響學會制備紅血球細胞原理原理多種去污劑可以溶解細胞膜上的磷脂化合物，從而使細胞膜破裂，釋放出細胞內物質。血紅蛋白在540nm有特異吸收峰。去污劑作用后的無細胞膜溶液于540nm處的A值大小可以表示其紅血球細胞對不同去污劑的敏感性。步驟步驟 紅血球等滲溶液的制備 取已加抗凝劑的豬血2.5mL，加生理鹽

7、水10.0mL，離心20方針（2000rpm），收集沉下的紅血球，用生理鹽水洗滌一次（5mL），再離心20分鐘（2500rpm），收集沉淀，加10mL生理鹽水，懸浮紅血球，即為紅血球等滲溶液，備用。 取4支試管各加0.2mL紅血球等滲溶液，分別對應加入10.0g/L的Triton X-100，Brij58，CTAB，SDS 5mL，小心混勻，2500rpm離心20分鐘，收集上清液，測540nm的A值（以相同操作，不含紅血球的去污劑作參比）。 以Triton X-100的A值作為100%的溶解作用，計算其它去污劑的相對溶解作用。1.不同濃度的中性去污劑對細胞膜的溶解作用取6支試管，各加生理鹽水5

8、mL，紅血球等滲液1.0mL，向各管對應加入10.0g/L、8.0g/L、6.0g/L、4.0g/L、2.0g/L、1.0g/L的Triton X-100 50Ul，小心混勻，置于37度恒溫水浴中20分鐘，2500rpm離心20分鐘，取上清液于540nm處測吸收值，計算相對溶解作用（參比液：5.0mL生理鹽水+50uL不同濃度的Triton X-100）。以Triton X-100的不同濃度為X軸，相對溶解作用為Y軸，作圖。實驗八實驗八 盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白目的和要求目的和要求掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。學習盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作

9、技術，包括制膠、灌膠、加樣、電泳、剝膠、染色及脫色等。了解盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的應用，利用盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質和血清球蛋白-血清清蛋白-鐵氧還原蛋白的混合液 原理盤狀聚丙烯酰胺凝膠，是由丙烯酰胺單體和少量的交聯劑甲叉雙丙烯酰胺，在催化劑的作用下聚合交聯而成的三維網狀結構的凝膠。改變單體的濃度或單體與交聯劑的比例，可以得到不同孔徑的凝膠，將次凝膠灌裝于直立的玻璃管中，再加樣品，進行電泳分離，稱為盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳。一般常采用7.5%的盤狀聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質，2.4%的分離核酸。盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳又常分為兩大類，第一類是連續的凝膠電泳，第二類是不連續的凝膠電泳不連續

10、的凝膠電泳亦可稱為盤狀電泳。在這種電泳過程中，除去一般的電荷效應外，還有兩種物理效應：（1）凝膠對樣品分子的篩選效應：顆粒小，形狀為圓球形的樣品分子，移動較快；顆粒大形狀不規則的樣品分子，通過凝膠孔洞時受到的阻力較大，移動較慢。（2）不連續系統對樣品的濃縮效應：高度的濃縮效應，大大提高電泳分離的分辨率，特別適用于稀濃度的樣品的分離。關于不連續系統的濃縮效應，可由兩方面進行分析（以堿性pH緩沖液體系為例）第一，兩層凝膠孔徑不同。第二，緩沖液與凝膠的離子成分和pH不同。本實驗采用不連續系統，堿性緩沖體系，分離血清蛋白質。由于具有電荷效應、分子篩效應、濃縮效應，所以分離效果好，分辨率高。實驗中聚合凝

11、膠時表面覆蓋一層水，是為了防止空氣中的氧氣進入混合液，使聚合作用受抑制，并保證膠面的平整。步步 驟驟1 分離膠的制備：TEMED（pH8.9）2mL；分離膠原液 4mL； A.P（0.14%） 10mL（加樣順序不可顛倒）。2 濃縮膠的制備：TEMED（pH6.7） 1mL；濃縮膠原液 2mL；核黃素（0.1mgml），1ml。3 上槽（略）4 加樣：BSA、胃蛋白酶各10-20L，混合樣品30-40L，豬血清5-10L，加1/2體積的蔗糖。電泳：2mA/管，10-20分鐘后，于3mA/管電泳至溴酚藍指示劑離膠下端0.5cm時，停止電泳。剝膠，染色。脫色繪圖，計算Rf值。實驗九實驗九 動物組織

12、核糖核酸的制備及測定動物組織核糖核酸的制備及測定目的和要求目的和要求1 學習和掌握用苯酚法及鹽溶液法從動物組織提取核酸的原理及操作技術。2 練習從動物組織提取RNA，并鑒定純度。實驗原理實驗原理利用苯酚法可以直接從動物組織中提取RNA，組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水層中，DNA和蛋白質則留在酚層中，向水層加入乙醇后RNA即呈白色絮狀沉淀析出。實驗十實驗十 脲酶脲酶KmKm值的簡易測定值的簡易測定目的和要求目的和要求掌握測定米氏常數的原理和方法，學習并掌握一般的數據處理方法實驗十一實驗十一 粗脂肪提取粗脂肪提取索氏（索氏（SoxhletSoxhlet）提取法）提取法目的

13、和要求目的和要求學習和掌握粗脂肪提取的原理和測定方法。熟悉和掌握重量分析的基本操作，包括樣品的處理、定量轉移、烘干、恒重等。實驗十二實驗十二 ATPATP的生物合成的生物合成綜合性實驗之一 2006-5-13一、目的一、目的1.了解ATP生物合成的意義。2.掌握無機磷的測定方法。3.掌握DEAE-纖維素薄板層析法測ATP的形成。二、原理二、原理在適當條件下，釀酒酵母分解發酵液中的葡萄糖，釋出能量，同時還利用無機磷，使AMP轉變成ATP，一部分能量即貯存于ATP分子中。因此，在發酵過程中，可測得發酵液中的無機磷含量降低和ATP含量的上升。實驗十三實驗十三 動物肝臟動物肝臟RNARNA的制備的制備

14、( (苯酚法苯酚法) )和純度測定和純度測定原理原理細胞內大部分RNA 均與蛋白質結合在一起，以核蛋白的形式存在。因此分離RNA時必須使RNA與蛋白質解離，并除去蛋白質。除去蛋白質的方法主要有：（1）用氯仿辛醇混合液劇烈振蕩，使蛋白質變性。（2）在冷的2mol/L鹽酸胍溶液中沉淀RNA，大部分蛋白質仍處于溶解狀態。（3）以去污劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，使核蛋白解離，蛋白質變性。（4）以含水的酚溶液除去蛋白質。去污劑和酚均能抑制RNA酶活力，有利于制備核酸大分子。目前應用最廣的是苯酚法。以酚水兩相系統分離RNA是將細胞或細胞器置于含有SDS的緩沖鹽溶液中，加等體積水飽和的酚，通過劇烈振蕩，然后離心形成上層水相和下層酚相。核酸溶于水相，被酚變性的蛋白質或溶于酚相、或在兩相界面處形成凝膠層。實驗所用的0.15mol/L緩沖鹽溶液系統可使大部分核糖核蛋白解離，在用酚處理時脫氧核糖核蛋白變性；在低溫條件下，從水相中除去，這樣得到的RNA制品中混雜的DNA量極低。RNA制品繼續用氯仿異戊醇處理，可以進一步除去其中含有的少量蛋白質。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉淀下來。實驗所得制品的核酸含量可用紫外吸收法和定磷法測定，然后用地衣酚顯色法測定RNA含量，二苯胺顯色法測定DNA含量，Folin酚試劑法測定蛋白質含量。實驗十四實驗十四 胰島素、腎上腺素對血糖濃度的影響胰島素、腎