1、競爭性RT-PCR PCR的終產物量取決于靶序列與競爭性序列量的起始比例。 理想情況下，靶序列與參照物以相同的效率擴增，在瓊脂糖凝膠電泳中區別開。競爭性RT-PCR參照物片段分兩類:- 同源性片段與靶序列只有微小差別- 非同源性片段除兩端引物模板區以外與靶序列不同競爭性RT-PCR面臨的問題變異主要來源是樣品RNA的純度和完整性，應設內源性參照物。若使用DNA參照物，反轉錄酶的效率未受控制。RT-PCR定量的條件 確定PCR反應曲線上的有效范圍，即在平臺效應出現以前PCR擴增得到的終產物與加入的RNA數量呈線性關系。 確定足夠的樣品數，保證可對PCR擴增產物量間差異進行統計分析。非競爭性RT-

2、PCR 目前主要采用熒光實時RT-PCR，放射性標記核苷酸的方法已基本淘汰。實時RT-PCR 實時RT-PCR就是在PCR擴增的每一個循環后分別檢測其PCR產量，借助計算機數據處理，可以描繪出PCR擴增循環過程中PCR產物變化曲線。 根據PCR 變化曲線計算出目標靶基因分子數。傳統RT-PCR與實時RT-PCR的流程比較熒光定量RT-PCR基本流程熒光測定的光學原理圖熒光測定的光學原理圖濾鏡輪濾鏡輪CCD相機相機光源光源濾光鏡濾光鏡96孔板孔板多元鏡多元鏡雙色鏡雙色鏡夫累舍爾透鏡夫累舍爾透鏡96孔透鏡組孔透鏡組反射鏡反射鏡Molecular Beacon MethodDye Incorpora

3、tion MethodHybridisation Probe MethodTaqmanTaqman熒光定量熒光定量PCRPCR技術技術特異性熒光特異性熒光 標記探針標記探針TaqTaq酶酶 53 53 外切酶活性外切酶活性設置內參照 分為兩種：在擴增反應中加入的外源參照物和樣品中正常存在的內源參照物。 內源性參照物通常使用“管家” 序列或rRNA。實時RT-PCR特點 擴增反應處于對數增長期，無平臺效應。 無需處理PCR反應產物，減少污染。 檢測范圍更寬，速度更快。ApplicationQuantificationMutation/Allele detectionMultiplex RT-PC

4、R Detection of mRNA splice variantsMutation/Allele detectionUse different reporter dyesOne increase homozygosityTwo increase heterozygosityMultiplex RT-PCRAdvantage: Time and reagent savingLimitation: availability of multiple reporters excitation and detection ability多重定量多重定量PCRPCR結果結果TNF-, TGF-, TN

5、F-and lymphotoxin-amplifications (FAM)in replicates of 5 18S ribosomal RNA endogenous control amplifications (VIC) showing all 20 sample wellsDetection of mRNA splice variants主要內容主要內容1. Taqman探針原理2. CT值和閾值的確定3. ROX內參比熒光的作用4. IPC內對照的作用退火，開始延伸退火，開始延伸535535ForwardPrimerReversePrimerTaqMan ProbeRQ替換替換53

6、5535ForwardPrimerReversePrimerRQ剪切剪切535535QR延伸結束延伸結束535535RQ熒光定量熒光定量PCRPCR實驗熒光強度的計算公式實驗熒光強度的計算公式Rn=總熒光強度RB=基本（空白）熒光強度XO=靶基因起始拷貝數EX=擴增效率（0 EX 1）n =擴增循環數RS=每個熒光分子的熒光強度SnXOBnREXRR)1 ( 達到閾值時的計算公式達到閾值時的計算公式RB, Rs 和 Ex 是確定的Rn=RT=閾值n=CT= 達到閾值時的循環數SCXOBTREXRRT)1 ( C CT T的推導過程的推導過程RT =RB+XO(1+Ex)CTRs log(RT

7、-RB)=log XO +CTlog(1+ Ex)+logRsCTlog(1+ Ex)=log(RT -RB)-log XO -logRs)1log(log)log()1log(logXSBTXOTERRREXCCT = -k logX0 + bCt起始DNA拷貝數C CT T值與起始值與起始DNADNA拷貝數的關系拷貝數的關系Rn (熒光信號)Cycle Number（循環數）Threshold（閾值）閾值的作用：確定閾值的作用：確定C CT T值值閾值 = 基線（背景）信號均值基線（背景）信號標準偏差 x 10基線的范圍：從第3個循環起到指數增長開始前3個循環止。一般取3-15循環。確定閾

8、值的標準：基線確定閾值的標準：基線基線閾值標準偏差3個循環閾值選擇的推導原理閾值選擇的推導原理1. 基線（空白）信號的產生是由于測量的偶然誤差引起的2. 偶然誤差的結果滿足對數分布3. 閾值 = 基線（背景）信號均值基線（背景）信號標準偏差 x 104. 由于測量的偶然誤差而導致測得的熒光信號大于閾值的概率小于1055. 當熒光信號大于閾值時，可以肯定是由于PCR的擴增使得熒光信號強度可以測量得到SampleNo TemplateThresholdBaselineRn+Rn- RnCtPCR PCR 反應曲線反應曲線未知樣品標準品：產生標準曲線內參比（Internal Standard）ROX

9、校正樣品管和加樣誤差內對照（Internal Control）：校正擴增效率的誤差+/-對照：檢驗試劑和儀器的可靠性6次重復：滿足統計學要求定量準確的要素定量準確的要素多色熒光技術多色熒光技術準確的熒光定量要求ROX校正和IPC校正檢材和對照最好在同一反應管中，誤差最小多重檢測要求儀器有多種熒光檢測能力只有ABI的儀器才具有四色檢測能力：uFAM：標記目的基因探針uVIC：標記第二個目的基因或IPC探針uTAMRA：淬滅基團uROX： 內參比熒光使用使用ROXROX內參比的效果內參比的效果使用使用ROXROX內參比的好處內參比的好處 報告熒光報告熒光參比熒光參比熒光樣品管1樣品管2不使用參比熒

10、光校正的結果使用參比熒光校正的結果ROXROX熒光內參比的作用熒光內參比的作用以固定濃度存在于TaqMan PCR緩沖液中，常用ROX熒光強度均一化(Normalize)： Rn = RReporter / RROX， Rn = Rn,sample Rn,blank影響熒光信號強度的因素包括：u光纖出口處的激光強度；管蓋厚度、透光性u緩沖液和反應體積等校正管間差異，保證實驗結果的重現性5 Nuclease Multiplex Assay5 Nuclease Multiplex AssayFAM dye labeled 35S TargetVIC dye labeled ER陽性內對照陽性內對照

11、(IPC)(IPC)為操作方便，取樣一般以克或uL為單位IPC一般選用基因組中單拷貝的管家基因，其定量結果代表了基因組的數量，也就是檢材中細胞的數量。CT = CT Sample - CT IPC將定量結果校正為以基因組為單位，不同樣品之間具可比性。陽性內對照陽性內對照(IPC)(IPC)IPC除了用于計算CT，校正定量結果外，還可以起到陽性對照的作用，用于判斷陰性結果的真偽。u真陰性檢材-；IPC+u假陰性檢材-；IPC-常用的內對照：u18S rRNAu-actinuGAPDH標準品的選擇標準品的選擇標準品可以從ABI購買，也可以自己制備標準品的單位并不重要，取決于對最終結果的要求：拷貝數

12、，%，ng/uL, mol/uL如轉基因定量的國際標準是%(w/w) ，標準品最好是先將不同重量比的轉基因與非轉基因食品粉末混合，然后抽提DNA；不要先抽好DNA，再用水梯度稀釋如果要得出的是樣品中的基因拷貝數，則梯度稀釋已知摩爾濃度的DNA目的基因目的基因CtCtFAMFAM = 40 = 40IPC (VIC layer) IPC (VIC layer) 基因基因CtCtVICVIC = 27 = 27內對照用于確認陰性結果內對照用于確認陰性結果目的基因目的基因CtCtFAMFAM = 40 = 40IPC (VIC layer) IPC (VIC layer) 基因基因CtCtVICVIC = 40 = 40假陰性結果假陰性結果目的基因目的基因CtCtFAMFAM = 29