1、總糖和還原糖的測定（3,5一二硝基水楊酸法）實驗報告前言糖在我們日常生活中隨處可見，我們吃的米飯、水果、零食中或多或少都含有一些糖類。同時，糖也是我們維持機體運動所必不可少的物質，沒有了它，就沒有了能量的來源。我們這次便走進實驗室探索糖類的奧秘。本次實驗我們將用3,5一二硝基水楊酸法測定總糖和還原糖中的含糖量。本次實驗中，我們除了要掌握還原糖和總糖的測定基本原理還要學習比色法測定還原糖的操作方法以及分光度法測定的原理和方法。首先，讓我們一起來了解一下它們的測定方法吧。還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽

2、糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖甘鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。一、實驗目

3、的1、掌握還原糖和總糖的測定的基本原理2、學習比色法測定還原糖的操作方法3、學習分光光度法測定的原理和方法二、實驗原理還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量(還原糖以葡萄糖含量計)。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內

4、，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖昔鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。三、材料與器具的準備。實驗材料：面粉。實驗試劑(1)、1mg/mL葡萄糖標準液準確稱取80c烘至恒重的分析純葡萄糖100mg,置于小燒杯中，加少量蒸儲水溶解后，轉移到100mL容量瓶中，用蒸儲水定容至100mL,混勻，4c冰箱中保存備用(2)、3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑將6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，力口至U500mL含有185g酒石酸鉀鈉

5、的熱水溶液中，再加5g結晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸儲水定容至1000mL,貯于棕色瓶中備用。(3)、碘-碘化鉀溶液：稱取5g碘和10g碘化鉀，溶于100mL蒸儲水中。(4)、酚猷指示劑：稱取0.1g酚猷，溶于250mL70%乙醇中。(5)、6MHCl和6MNaOH各100mL。實驗器材(1)具塞玻璃刻度試管：20mLX11(2)大離心管：50mLX2(3)燒杯：100mLX1(4)三角瓶：100mLXl(5)容量瓶：100mLX3(6)刻度吸管：1mLX1;2mLX2;10mLXl(7)恒溫水浴鍋(8)沸水浴(9)分光光度計分光光度計的基本原理是溶液中的物質在光的照射下，產生了對

6、光吸收的效應，物質對光的吸收是具有選擇性的。各種不同的物質都具有其各自的吸收光譜，因此當某單色光通過溶液時，其能量就會被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質的濃度有一定的比例關系，也即符合比色原理Lambert-Beerslaw:數學表達式:A為吸光度A=lg(1/T)=KCLT為透射率，是投射光強度比上入射光強度C為吸光物質的濃度L為吸收層厚度K為吸收系數物理意義是當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的西光物質時，其吸光度A與吸光物質的濃度C及吸收層厚度L成正比.四、實驗步驟器材與材料準備完畢之后，便開始按照以下步驟進行實驗。首先，制作葡萄糖標準曲線。取6支20mL具塞刻度試管編號，按下表分

7、別加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標準液、蒸儲水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應液。-012345標準葡萄糖溶液ml00.20.40.60.81.0蒸儲水ml2.01.81.61.41.21.0DNS試齊1Jml1.51.51.51.51.51.5接下來，提取還原糖。準確稱取2.00g食用面粉，放入100mL燒杯中，先用少量蒸儲水調成糊狀，然后加入50mL蒸儲水，攪勻，置于50。叵溫水浴中保溫20min,使還原糖浸出。過濾，將濾液收集在100ml容量瓶中，用蒸儲水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液。緊接著，提取總糖。準確稱取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中

8、，加15mL蒸儲水及10mL6MHCl,置沸水浴中加熱水解30min(水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查)。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1滴酚吹指示劑，用6mol/LNaOH中和至微紅色，用蒸儲水定容在100mL容量瓶中，混勻。將定容后的水解液過濾，取濾液10mL,移入另一100mL容量瓶中定容，混勻，作為總糖待測液。然后，取4支20mL具塞刻度試管，編號，6、7、8、9,按下表所示分別加入待測液和顯色劑。管號還原糖待測液(ml)總糖待測液(ml)蒸儲水(ml)DNS(ml)60.51.51.570.51.51.58111.59111.5最后，用分光光度計進行比色。先將機器打開預熱20分鐘。

9、選擇540nm的波長。再按MODE鍵切換到T,將黑體放入光路中，合上蓋，0鍵校零。再按MODE鍵切換到A,將倒入比色皿中的0號液體放入到光路中，合上蓋，100鍵校零。再將倒入比色皿中的各號液體放入到光路中即可測得光密度值。五、注意事項:1、每次測量前檢查，檢查波長是否所需值;2、比色皿應拿磨砂面，不可用手接觸透光面；3、比色皿在盛裝樣品前，應用所盛樣品沖洗兩次，裝樣量為比色皿的2/3容積;4、向比色皿加樣時，若樣品流到比色皿外壁時，應用濾紙點干，切忌用濾紙擦拭,以免比色皿出現劃痕；5、測量結束后應用蒸儲水清洗比色皿，清洗干凈后放起.六、數據處理試管123456789光密度值(nm)0.0250

10、.1320.1860.2970.3240.0770.0820、710、73錦萄糠標準曲線0y=0.3557x-0.0172查曲線所將葡萄魘菖克數乂提取液總體積/測定時取用體積。還原糖（N）XIOOP樣品毫克數+J查曲線所得求解后還原搪亳克數X稀釋倍數。總糖（VXD.9X1D0+J樣品毫克數1根據公式可以算得還原糖為0.27mg總糖為2.07mg.則還原糖百分含量二毫克數X提取液總體積測定時取用體積+樣品的質量=13.5%總糖的百分含量=毫克數X稀釋倍數一樣品質量X0.9=18.63%總結：本實驗測得還原糖的含量為13.5%，總糖含量為18.63%,R2為0.9739,實驗數據還是略有偏差。七、誤差分析1、在配置制作葡萄糖標準曲線的溶液時，使用移液管移動液體，由于不夠熟練，所以并沒有準確移動相應的液體量，導致R2偏低。2在提取還原糖時，由于我們采用的是最簡單的棉花過濾方法，這個方法可能導致有許多還原糖被浪費，導致所測還原糖含量偏低。止匕外，我們也需要注意，在標準的實驗中，標準曲線的制定與樣品含糖量必須同時進行，一起顯色和比色。八、體會。這次試驗我們學習了植物總糖、還原糖的提取鑒定及其含量測定，掌握了還原糖和總糖測定的基本原理，同時也對比色法測定還原糖有了一定了解并且還掌握了使用分光光度計測定還原糖和總糖的光密度值收獲許多，試驗中要求每只試管同時進行水浴加熱加熱時間視實驗