1、第八章酶分子的定向進化T9肺一節簡介一、理論來源隨著電子科學的迅猛發展及計算機的廣泛應用，酶學研究跨入了新的階段。利用基因工程的原理，可以在實驗室中模擬自然界中的漫長進化過程，并由此建立了酶分子的定向進化方法，用于構建新的非天然酶或改造天然酶分子。酶分子的改造著重在兩個方面:-通過各種方法對天然酶或其突變體進行研究，獲得酶分子的各類信息，以此為依據對酶分子進行改造，這就是基于序列的合理化設計方案(sequentialrationaldesign),如化學修飾、定點突變等。_-不需要準確的酶分子結構信息而通過隨機突變、基因重組、定向篩選等方法對酶進行改造，即利用基因的可操作性，模擬自然界的演化過

2、程的非合理-(irration、雜合進化等。可定向進化(directedevolution)即屬于蛋白質的非合理設計。、發展方向IM!i!每催化的精確性和有效性往往并不能滿足通常的工業要求，天然酶通常缺乏有商業價值的催化功能及其他性質。因此，對天然酶分子水平上的改造，顯得十分重要。酶分子仍具有巨大的進化潛力，是酶的體外定向進化的基本先決條件。酶分子存在進化潛力的主要原因如下:天然酶在生物體內存在的環境與酶的實際應用環境不同實際應用中，期待酶的活力和穩定性越高越好，但在生物體內對環境適應的進化主要表現在整體的適應能力、調控能力的增強某些酶或蛋白質待進化的性質不是在生物體內所涉及的,如對蛋白質藥物

3、改造消除其副作用酶分子的定向進化是從一個或多個已經存在的親本酶a1為取島肋活力的忒因篩選平板正掘變富如的蔓因炎變悴；蓊囪突變庫Y止突曼三O負負變粉錨P（R:濟逬化蘭基耀曲，監aw麵rm®觀I遊歩舸怖制宜肌活力及熱椅宜性其原理如圖81：（天然或人為獲得的）出發，經過基因的突變和重組，構建一個人工突變酶庫，通過篩選最終獲得預先期望的具有某些特性的進化酶。四、定向進化的選擇策略雖然采用進化方法可提供新的有價值酶，即已經存在有足夠大的突變庫，但酶的功能突變常常被埋沒在眾多的中生突變和不利突變群中。采用回交(backcrossing)法，將已進化的子代突變酶基因與野生酶基因組重組，可以排除這種

4、干擾。篩選或選擇在酶的體外定向進化中至關重要，直接關系到定向進化的成敗。因此，篩選方法必須靈敏，至少與目的性質相關9二節酶分子定向進化的歷一、萌芽階段:二、奠基階段柳三、發展階段*丿丿/dJ八J/J平卜定冋改造卑一分子的是20fe廣rII，八八2/|qrn;iri?h匸日P，炸w<IJJJylIJM/ljlAlI廠l92*Mi4i_L>.卩“t.u憶|小八WJ曰;思乍FibJ5Ir廠初匕鄉撫廠？廣*訃匪|："口rri11f廠/：、75Jy*/4B卻r丿E1門1£氏II彳j2誌個家彰:屋二此話基閃»LI這個分子進化的實驗巧妙地在體外模擬了自然進化的過程，

5、但沒有重要的應用價值。一太約20年后出現了真正有意義的改造酶分子性.質的定向進化。%-brr/Zr：rtNI二IIfA嚴L*y乂匸.yp丿I°廠；/荊了門函桿茵I八IMfl筍.J丿、/zZJ1I/1一j、丿yj生，獲得了可以水解半玄吵佢廠F乂*"JJLOa_jf"*_廠“e|(|-/»_sxsi"；亠一一蠢ni冗彳£|(一丿Iy不FnVC1F;itpFnJJjJIf"-J"IL/lJr"rr、s日酉八I、51I尋*-.L.ftI»b0|盒單>>rwip-L_*一F0I-|&*

6、71f*!Iii5/riI'sz111iw丄匚I川(巧,I?Injrri*hAII'RI!I-z2fliLtJ|rI*5|Iff"f*尸r*ff'"IJillIiI<IisSBSSi/7/hJ/JJ/j'、.；、“、址：.務、;心7、:、宀：、.、：；、.S5、.:、.、;*、w'j?、error-oronePCR）和DNA改組方法成功開發標志著酶分子定向進化技爲m'、；熟。4在酶分子的定向進化改造中，易彳DNA改組技術配合使用通過隨機突變和優姜重組來構建酶分子的基因突變庫。第三節定向進化的策略一、易錯PCR技術為代表的

7、無性進化二、DNA改組技術為代表的有性進化匚三、基因家族之間的同源重組四、外顯子改組五、雜合酶六、計算機輔助設計七、突變庫的構建及應用、易錯PCR技術為代表的無性進化易錯PCR是在采用Taq酶進行PCR擴增目的基因辱通過調整反應條件，改變Taq酶的突變頻率，從弗以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變構建突變庫。如提高鎂離子濃度、加入猛離子、改變體系中四種dNTP濃度等。關鍵：突變頻率適中，理論上每個靶基因導入的取代殘基個數為1.55之間。連續易錯PCR(sequentialerror-pronePCR),將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次必R擴增的模板，連續反復地進行隨機誘變，使每我得

8、的小突變累積產生重要的有益突變。二、DNA改組技術為代表的有性進化DNA改組又稱有性PCR(sexualPCR),基本操作過程是從正突變基因庫中分離岀來的DNA片斷用脫氧核糖核酸酶I隨機切割,得到的隨機片斷經過不加引物的多次PCR循環，在PCR循環過程中，隨機片斷之間互為模板和引物進行擴增，直到獲得全長的基因，導致來自不同基因的片斷之間的重組。如圖8-2。19醴一荃因易詩PCR槌突變表包圖8-2DNA改組原理其他有性進化體夕卜隨機重組法(random-priminginvitrorecombination,PCR):以單鏈為模板，配合一套隨機序列引物，先產生大量互補于模板不同位點的短DNA片段

9、，由于堿基的錯配和錯誤引發，這些短DNA片段中也會有少量的點突變。可重復操作直至獲得滿意的進化酶性質。交錯延彳申法(staggeredextensionprocess,StEP):在PCR反應中，抱常規的退火和延伸合并為一步，并大大縮短其反應時間，從而只能合成非常短的新生鏈，經變性的新生鏈再作為引物與體系內同時存在的不同模板退火而繼續延伸，反復進行直到產生完整長度的基因，結果產生間隔的含不同模板序列的含大量突變組合的新生DNA分子。基因家族之間的同源重組以單一的酶分子基因進行定向進化時，基因的多樣化起源于PCR等反應中的隨機突變，但由于突變大多是有害的或者是中性的，采用這種過程集中有利突變的速

10、度比較慢。從自然界中存在的基因家族岀發，利用它們之間的同源順序進行DNA改組實現同源重組，由于每一個天然酶的基因都經過千百萬年的進化，并且基因之間存在比較顯著的差異，所以獲得的突變重組基因庫中既體現了基因的多樣化，又最大限度的排除了那些不需要的突變。此策略拓寬了酶分子突變庫中的序列空間，而且限制了有害突變的摻入而不會增加突變庫的大小和篩選難度，從而保證了對很大的序列空間中有希望的區域進行快送定彳立。x27外顯子改組真核基因中，編碼序列被內含子間隔分開，轉錄后內含子被剪切，僅剩下編碼序列（外顯子）。在許多基因中一個外顯子編碼一個折疊結構域，因此Gilbert認為內含子間的重組可使獨立的外顯子組裝

11、成編碼新蛋白質的基因，此過程即外顯子改組。關于外顯子在蛋白質進化中的作用有兩種觀點： “原生內含子”假說：認為當前所有的蛋白質都經過外顯子改組； “后生內含子”假說：認為外顯子改組僅出現在真核細胞中，以提高這些生物基因的韌性。兩種假說都承認外顯子改組是蛋白質進化的重要機制，因此人為模擬此自然進化過程定向進化酶分子將是獲得新酶的頗具吸引力的途徑。五、雜合酶:1雜合酶的定義把來自不同酶分子中的結構單元或是整個酶分子進行組合或交換，以產生具有所需性質的優化酶雜合體。2研究雜合酶的意義與應用蛋白質工程應用于酶學的主要目的是通過改變現存酶的特性，創造出具有新特性或性能有所改善的酶0研究雜合酶的意義心天然

12、酶在現存的工業條件下穩定性較差或其催化水平很彳氐；心天k酶在工程菌中的折疊效率較差或對蛋白酶敏感；心酶的催化活力需要擴大或減小；心需要創造具有新反應活力的酶。雜合酶的應用：心改變酶的非催化特性；心創造具有新活力的酶；心研究酶的結構與功能之間的關系。293展望在新酶的開發和現有酶的改造利用方面，雜合酶技術顯示了巨大的應用前景。雜合酶技術是將DNA水平上的突變篩選與蛋白質水平上的酶學研究相結合的一門綜合技術，將傳統酶學活性篩選法同簡便的DNA重組技術有機地結合起來，使酶工程的研究摒棄了（繁瑣的蛋白質序列研究和繁重的菌種選育的傳統做法，為加）快構建新酶和改進生物工藝過程開創了一條新路。DNA與蛋白質

13、研究技術的突破也必將推動雜合酶技術的發展。新克隆的基因序列不斷增多，基因組序列信息日新月異，提/供了越來越多的同工酶信息，使我們能夠更正確地預測可作為分子篩選引物的保守序列和用這些引物對培養和未經培養的微生物進行篩選。從篩選的角度看，發展趨勢是從活性篩選向分子篩選轉移。基因數據庫和其他生物信息工具的利用將越來越頻繁。（:篩選工作的最終關鍵是開發具有特異性的分析方法。20?六、計算機輔助設計對酶分子結構信息及其它與酶分子相關的結構數據的充分利用可以大大減小由于盲目的隨機突變形成的突變庫容量過大而給篩選帶來的困難。FrancesHArnold用計算機的方法限制突變庫的大小，減小搜索范圍從而優化酶的

14、定向進化方法。篩選正向突變可能性大的突變庫有效地減小了突變庫的大小，增大了篩選效率和成功的可能性。31七突變庫的構建及應用（一）構建理想的基因文庫要考慮的因素 1基因文庫的質量 （1）基因文庫的代表性O文庫中包含的DNA分子應能完整地反映來源基因的全部可能的變化和改變，文庫質量的最重要的指標，可用庫容量來表示。 （2）突變基因片段的序列完整性O文庫中重組或突變DNA片段應盡可能完整地反映出天然基因的結構。 2.文庫篩選可選擇的具體方法O最理想的情況是對于具體構建出的一個突變基因文庫應能夠使用多種篩選方法。22（二）構建突變文庫的載體系統.1.入噬菌體載體系統最早使用的載體系統，在載體本身的設計

15、方面已經相當成熟。優點：O插入片段的載容量大，適合于大片段的克隆。O感染效率高、鑒定容易，有較好的質量控制指標。O基因文庫質量高、代表性好，穩定性好，適合長期保存。缺點：O構建成文庫后，可采用的文庫篩選方法有限。O基因片段無法在宿主細胞中表達。2質粒載體系統優點：O可實現對基因文庫的功能性篩選。實現基因的功能性篩選需滿足的條件：O文庫中的基因編碼序列能在宿主細胞中表達，產生具有天然構象的編碼產物；O在檢測岀目的功能的同時，能直接或間接編碼這一表型的基因。缺點：載體容量小，長片段易丟失。轉化效率低，易失活。3哺乳類細胞表達載體這種研究策略在發現和鑒定岀人類細胞中與重大生理現象和重大疾病相關的功能

16、基因的工作中顯示了良好的應用前景,是基因文庫技術發展的一個新動向。37(三)文庫的篩選 1篩選文庫的策略根據已知基因編碼產物的特定活性進行篩選。O不需要附加任何先決條件，通過檢測在特定條件下來源于兩個文庫的基因編碼產物之間發生相互作用的情況從而確定出兩個文庫中所有可能在生理上發生相互作用的基因對，描繪出某一特定類型細胞內表達出的基因之間發生的基因相互作用的聯絡圖。 2.基于基因編碼蛋白質的檢測篩選表達文庫o(1)噬菌體表面展示系統o(2)酵母雙雜交系統O(3)酵母單雜交系統（四）基因文庫技術在功能基因組學研究中的應用人類基因組計劃功能基因組學第四節定向進化的應用一、提高酶分子的催化活力實例1：

17、L-天冬氨酸酶定向進化研究實例2：6天冬氨酰二肽酶的定向進化實例3：#二、提高酶分子的穩定性.提高酶分子的穩定性，尤其是熱穩定性，是蛋白質褲究人員另一個最基本的愿望在熱穩定性的定向進化中，篩選比選擇更加有效3941p曇!瞬驚斂詁四、提高底物的專一性和增加對新底物催化活力提高底物專一性，可以使酶更加適應工業化生產,而底物專一性是可以通過進化來提高的利用結合能力來代替催化能力進行篩選的不利之處是,有時提高結合能力超出了酶反應所需最適值，反而降低酶的催化效率五、對映體選擇性的定向進化定向進化可以提高R轉氨酶的對映體選擇性六、變換催化反應專一性最近研究表明，立體選擇性酶的專一性是可以變化的，也就是酶的

18、柔性，利用定向進化方法可以改變酶白勺專一性調整酶的底物專一性對于合理化設計而言是十分困難的，但對于定向進化卻是一種比較容易達到的目的第五節總結與展望酶分子定向進化策略是非常有效的、更接近于自然進化過程的一種蛋白質工程研究新策略，是分子進化的一個重要分支，是組合化學的思想和方法在酶分子改造上的應用以基因重組技術為表現形式，有性進化思想對于酶（蛋白質）的改造具有里程碑式的意義,因此定向進化是在組合化學思想和方法粵出上的又一次飛躍>酶的體外定向進化，使在自然界需要幾百萬年的進化過程縮短為幾年、幾個月甚至更短的時間，這無疑是蛋白質工程技術發展的一大飛躍表81列舉了一些酶定向進化的可喜結果：表備1購時體知定向逬優應用實例性蘭突變力他前機相活件血定托城鉗PC1?什內nt胺陽仇活力/底物專一性l>NAi£組站車桿fliah'i齡binta遙性對弗基犁曲聲-1底物專一桂用機H1活性艸PCR/TJNA&ftl戕物(?一世盤式怫變矗物性DNA改魁終典光逬白菠光DNASktH惟輸電一性Mpcr/dnaAj