1、分子生物學基本研究法（上）分子生物學基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質操作技術及蛋白質操作技術第五章 扉頁：扉頁： 當你進入實驗室時，要像脫去外衣那樣放下你當你進入實驗室時，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因為實驗操作中不能有一丁點兒的想象，的想象力，因為實驗操作中不能有一丁點兒的想象，否則，你對事物的觀察就會受影響；當你翻開書本否則，你對事物的觀察就會受影響；當你翻開書本的時候，你又必須盡可能展開想象的的時候，你又必須盡可能展開想象的“翅膀翅膀”，否，否則，你就不可能走在別人的前面。則，你就不可能走在別人的前面。RNA基本操作技術基本操作技術真核生物基因組真核生物基因組DNA龐大，有大量

2、重復序列，很難直龐大，有大量重復序列，很難直接分離得到靶基因片段。而接分離得到靶基因片段。而cDNA來自反轉錄的來自反轉錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選，無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快文庫，可較快地分離到相關基因。地分離到相關基因。Trizol總總RNA提取試劑提取試劑 TIANGEN rRNA電泳后的三條特征性條帶電泳后的三條特征性條帶28S、18S、5S (特別是特別是28S和和18S特征性條帶特征性條帶) 是鑒定總是鑒定總RNA純度純度和完整性的重要參數。和完整性的重要參數。RNA的抽提方法RNA Extraction by TRIzol使用BioSpcetrometer分光

3、光度計進行快速檢測核酸mRNA Extraction from Cell CulturemRNA Extraction from Tissue5.32. mRNA的純化 寡聚（寡聚（dT）纖維素柱色譜法：）纖維素柱色譜法： 利用利用mRNA3端含有端含有PolyA+的特點，當的特點，當RNA流經寡聚流經寡聚dT纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，用下，mRNA被特異性地結合在柱上，再用被特異性地結合在柱上，再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經過兩次此。經過兩次此柱可得到較高純度的柱可得到較高純度的mRNA.圖圖5-14PolyATtractmRNA

4、的分離的分離純化過程簡圖。純化過程簡圖。每個Oligotex Kit 包括用于結合poly A+ mRNA的Oligotex 樹脂，和用于洗滌、洗脫結合的mRNA的離心柱。Oligotex mRNA Kits可從總RNA中純化mRNA，回收poly A+體外轉錄子。Oligotex Direct mRNA Kits 可從細胞和組織中純化mRNA。mRNA Extraction from Total RNA5.3.3 cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）：在體外以mRNA為模板，利用反轉錄酶和DNA聚合酶合成的一段雙鏈DNA。cDNA 的合成5.3.4 cDNA文庫的構

5、建 cDNA文庫：文庫：是指將某種生物體基因組轉是指將某種生物體基因組轉錄的全部錄的全部mRNAmRNA經反轉錄產生的經反轉錄產生的cDNAcDNA片段片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNAcDNA文庫。文庫。基因文庫的建立基因組基因組DNADNA文庫文庫cDNAcDNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫與文庫與cDNAcDNA文庫的比較文庫的比較基因組文庫與基因組文庫與cDNA文庫的差別文庫的差別 基因組文庫中包含了所有基因，而基因組文庫中包含了所有基因，而cDNA文庫只包含表達的文庫只包

6、含表達的基因，缺乏內含子和調控序列，在研究基因結構時用處不大基因，缺乏內含子和調控序列，在研究基因結構時用處不大 cDNA文庫代表了文庫代表了mRNA的來源，轉錄本在豐度上有差別，的來源，轉錄本在豐度上有差別，而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列 不同細胞類型制備的不同細胞類型制備的cDNA文庫包含一些共同序列和獨特序文庫包含一些共同序列和獨特序列，可用于分離差別表達的基因，基因組文庫中不能列，可用于分離差別表達的基因，基因組文庫中不能 基因組文庫由于含有不表達序列，比基因組文庫由于含有不表達序列，比cDNA文庫大文庫大 mRNA在不同組織之

7、間存在豐度差異，因此在不同組織之間存在豐度差異，因此cDNA文庫在構文庫在構建時對于建時對于mRNA含量較少的就比較困難，而基因組文庫不存含量較少的就比較困難，而基因組文庫不存在這樣的問題在這樣的問題5.3.5 基因文庫的篩選基因文庫的篩選5.3.5.1 核酸雜交法5.3.5.2 PCR篩選法5.4 SNP的理論與應用 SNP的定義定義：單核苷酸多態性 ( single nucleotide polymorphism，SNP) 主要是指在基因組DNA序列中由于單個核苷酸的突變而引起的多態性。 是第三代遺傳標記。5.4.1 SNP概述 單倍型：是指位于染色體上某一區域的一組相關聯的SNP等位位點

8、。 SNP分類： cSNP 同義cSNP 非同義cSNP pSNP rSNP5.4.2 SNP的檢測技術傳統的傳統的SNP檢測方法使用的技術主要有：檢測方法使用的技術主要有： 限制性酶切片段長度多態性（限制性酶切片段長度多態性（RFLP）；）； PCR單鏈構象多態性（單鏈構象多態性（PCRSSCP）；）； 毛細管電泳；毛細管電泳； 變性高效液相色譜（變性高效液相色譜（DHPLC）等。）等。目前獲得新的目前獲得新的SNP最常見的方法是：最常見的方法是： 通過通過DNA測序法測序法2.5.2.1 基因芯片技術 是在固相支持介質上進行分子雜交和原位熒光檢測的一種高通量SNP分析方法。 通過激光掃描，

9、可根據熒光強弱或熒光的種類檢測出被檢序列的堿基類別。 優點：高通量優點：高通量 一次可對多個一次可對多個SNP進行規模性篩選進行規模性篩選 被檢起始材料少被檢起始材料少 操作步驟簡單操作步驟簡單 缺點：芯片設計成本高缺點：芯片設計成本高 若樣品復雜，有些若樣品復雜，有些SNP不能被檢出不能被檢出5.4.2.2 Taqman 技術5.4.2.3 分子信標技術 分子信標：是一種呈莖環結構分子信標：是一種呈莖環結構的熒光標記的寡核苷酸，環狀的熒光標記的寡核苷酸，環狀區與靶序列特異性結合，莖干區與靶序列特異性結合，莖干區由區由58個堿基組成，個堿基組成，5帶有帶有熒光發生基團，熒光發生基團，3帶有熒光

10、猝帶有熒光猝滅基團。自由狀態時，發生熒滅基團。自由狀態時，發生熒光共振能量轉移，無熒光；當光共振能量轉移，無熒光；當分子信標與靶分子結合時可檢分子信標與靶分子結合時可檢測到熒光。測到熒光。5.4.2.4 焦磷酸測序法(Pyrosequencing ) 四種酶催化的酶級聯反應四種酶催化的酶級聯反應:DNA :DNA 聚合酶、硫聚合酶、硫酸化酶酸化酶( (ATP sulfurylaseATP sulfurylase) ) 、熒光素酶熒光素酶( (luciferaseluciferase) ) 和和雙磷酸酶雙磷酸酶( ( apyrase) apyrase) 。 反應底物：反應底物：APSAPS和熒光素和熒光素（luciferinluciferin） 原理：原理：DNA DNA 聚合酶在一種聚合酶在一種dNTPdNTP的存在下進的存在下進行引物延