1、分子生物學討論課討論題第一頁，共33頁。討論題目：已知目的基因的cDNA序列（GenBank登錄號：AK135903.1），擬采用基因工程技術在哺乳動物細胞中表達該序列中的133-1941位核苷酸序列，請設計實驗方案。第二頁，共33頁。根據133-1941的序列，設計PCR引物從cDNA中擴增該序列得到擴增產物后將產物插入質粒該質粒擴增后轉染哺乳動物細胞，純化后進行表達1234我們的方案：我們的方案：第三頁，共33頁。根據133-1941的序列，設計PCR引物第四頁，共33頁。引物設計目的、原理及原則1搜索、設計引物3學習使用GenBank2根據原則篩選引物4第五頁，共33頁。引物設計的目的引

2、物設計的目的p 目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。引物設計的原理1、 擇合適的靶序列：設計引物之前，必須分析待測靶序列的性質，選擇高度保守、堿基分布均勻的區域進行引物設計。 2、 長度：一般來說，寡核苷酸引物長度為 1530bp。 3、 Tm 值：引物的 Tm 值一般控制在 5560，盡可能保證上下游引物的 Tm 值一致，一般不超過 2。 4、 （G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般為 4060。 5、 堿基的隨機分布：

3、引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的 3端不應超過 3 個連續的 G 或 C。 6、 引物自身：引物自身不存在連續 4 個堿基以上的互補序列，否則會影響到引物與模板之間的復性結合，尤其避免 3末端的互補。 第六頁，共33頁。引物的設計原則（詳見課本P.164） 引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。 產物不能形成二級結構。 引物長度一般在1530堿基之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續4個堿基的互補。 引物之間不能有連續4個堿基的互補。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。第七頁，共3

4、3頁。第八頁，共33頁。1 1. .從從/nuccore//nuccore/網站中對該基因進行搜索，輸網站中對該基因進行搜索，輸入登錄號：入登錄號：AK135903.1AK135903.1第九頁，共33頁。2.查詢可知其序列為查詢可知其序列為第十頁，共33頁。3.直接在直接在genbank中得到的引物序列結果中得到的引物序列結果pair3、pair5的3端有三個連續的堿基，舍去。pair1的3端末尾有堿基A，舍去。第十一頁，共33頁。pair6，pair7的3端末尾是堿基A，舍去。所以，可用

5、的引物序列為：pair2、pair4第十二頁，共33頁。/tools/primer-blast/搜索引物第十三頁，共33頁。第十四頁，共33頁。點擊 get primers后得到不同的引物方案第十五頁，共33頁。從從cDNA中擴增該序列中擴增該序列第十六頁，共33頁。（1）取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 l；上游引物（10 pM）2 l；下游引物（10 pM）2 l；dNTP(2 mM) 4 l；10PCR buffer 5 l；Taq 酶（2 u/l）1 l； （2）加入適量的ddH2O，使總體積達50 l。

6、輕輕混勻，離心； （3）設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內參DNA，作為對照； （4）電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果； （5）密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。一、一、PCR第十七頁，共33頁。主要原料模板DNATaqDNA聚合酶引物（提前設計并合成與 目的DNA兩側互補的引物，瓊脂糖凝膠電泳，分離和純化PCR產物-）二、利用PCR技術擴增目的基因第十八頁，共33頁。得到擴增產物后將產物插入質粒第十九頁，共33頁。基因表達

7、載體的構建基因表達載體的構建第二十頁，共33頁。表達載體構建流程獲得人工質粒載體分子(pBR322)用限制性核酸內切酶（BamH I：GGATCC）切割目的基因DNA片段與運載體堿性磷酸酶處理載體（去掉線性DNA分子5端磷酸根，防止質粒自身環化，便于與目的基因片段連接）用DNA連接酶連接運載體和目的基因第二十一頁，共33頁。轉染與純化轉染與純化第二十二頁，共33頁。原理：原理： 外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細

8、胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法。利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。第二十三頁，共33頁。轉染的步驟轉染的步驟細胞傳代(1)試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養

9、皿，離心管。(2)棄掉培養皿中的培養基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘（37。C，5%CO2)。用手輕拍培養瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。(4)加入1ml的含血清培養基終止反應。(5)用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。(6)將培養液裝入離心管中，1000rpm離心5min。(7)用培養液重懸細胞，細胞計數后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養皿。(8)將合適體積完全培養液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養皿中，使其均勻分布。第二十四頁，共33頁。(9)將培養皿轉入CO2培養箱中培養，第二天轉染。細胞轉染1）轉染試劑的

10、準備A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。2）選擇合適的混合比例（1：11：2/脂質體體積：DNA質量）來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。5）將混合液在室溫放置1015分鐘。6)吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。7）加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。8）到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養基繼續培養2448小時。第二十五頁，共33頁。第二次細胞傳代1） 在轉染后

11、24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。2） 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養皿將細胞重新粉入培養皿中。3） 在正常條件下培養24小時后按照染色要求條件固定。第二十六頁，共33頁。 原理 PCR產物一般都含有過量的引物、Tag DNA酶及dNTP，這些成分的存在將直接影響到后續的酶切、雙脫氧PCR測序反應等過程，因此有必要除去。 目前核酸純化的方法有很多，商用化試劑盒的出現使得DNA的純化過程變得更加簡便快捷。 擴增的PCR產物如利用T-Vector進行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產物純化。第二十七頁，共33頁。3、

12、再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次，每次回收上層水相。2、加等體積氯仿混勻后用微型離心機10000rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中. 這樣抽提一次， 可除去覆蓋在表面的礦物油。4、在水相中加300l 95乙醇，置-20下30min沉淀。.JPG1、 取 反 應 產 物 加100l TE.。 第二十八頁，共33頁。5、 在 小 離 心 機 上10000rpm離心10min，吸凈上清液。加入1ml 70乙醇，稍離后，吸凈上清液.重復洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。.第二十九頁，共33頁。Wizard PCR DNA純化系統可以快速、有效、可靠地提取PCR擴增液中的

13、DNA，提純后的DNA可用于測序、標記、克隆等。 該系統中含有的試劑和柱子可供50次PCR產物的純化，試劑包括： 50ml Wizard PCR DNA純化樹脂 5ml 直接提取緩沖液 50支 Wizard微型柱 第三十頁，共33頁。3、加1ml PCR DNA純化樹脂，1分鐘內渦旋混合3次。2、加100ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。4、取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進入微型柱。1、吸取PCR反應液水相放于1.5ml eppendorf管中。第三十一頁，共33頁。 5、將注射器與微型柱分開，取出注塞， 再將注射筒與微型柱相連，加入2ml 80%異丙醇，對微型柱進行清洗。6、取出微型柱置于epp