1、基因工程又叫做基因工程又叫做基因拼接技術基因拼接技術或或DNA重組技術重組技術。是指按照人。是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，們的愿望，進行嚴格的設計，通過通過體外體外DNA重組重組和和轉基因轉基因等等技術，賦予生物以新的遺傳特技術，賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。新的生物類型和生物產品。 DNA 重組技術的基本工具重組技術的基本工具本節知識內容 1.1 DNA1.1 DNA重組技術的基本工具重組技術的基本工具專題一專題一 基因工程基因工程“分子手術刀分子手術刀” 限制酶限制酶 “分子縫合針分子縫合針” DNA連接酶連接酶 “分

2、子運輸車分子運輸車” 基因進入受體細胞的載體基因進入受體細胞的載體 粘性末端粘性末端平末端平末端1、種類：、種類：Ecoli DNA連接酶連接酶T4 DNA連接酶連接酶 來源：來源：大腸桿菌大腸桿菌作用：作用：使黏性末端之間連接使黏性末端之間連接來源：來源： T4噬菌體噬菌體作用：作用：既能連接黏性末既能連接黏性末端也端也 能連接平末端，但能連接平末端，但連接平末端之間的效率連接平末端之間的效率比較低比較低2、作用部位：、作用部位： 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 DNA連接酶連接酶DNA聚合酶聚合酶連接連接DNA鏈鏈雙鏈雙鏈單鏈單鏈連接部位連接部位在兩在兩DNA片段之間片段之間形成磷酸二酯鍵形成磷酸二

3、酯鍵將單個核苷酸加將單個核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的3末端的末端的羥基上，形成磷羥基上，形成磷酸二酯鍵酸二酯鍵是否需要模板是否需要模板不需要模板不需要模板需要模板需要模板DNA連接酶與連接酶與DNA聚合酶的比較：聚合酶的比較：基因的載體“分子運輸車”載體必須具備的條件：載體必須具備的條件： 1、具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接；、具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接； 2、能夠在自主復制，或整合到染色體、能夠在自主復制，或整合到染色體DN上隨染色上隨染色體體DNA進行復制；進行復制； 3、具有某些標記基因，便于進行篩選。（如抗菌素、具有某些標記基因，便于進行篩選。（

4、如抗菌素的抗性基因、產物具有顏色反應的基因等的抗性基因、產物具有顏色反應的基因等 ） 4、對受體細胞無害、對受體細胞無害 5、大小適中，便于操作、大小適中，便于操作載體的作用：載體的作用： 1、將外源基因轉移到受體細胞中去。、將外源基因轉移到受體細胞中去。 2、利用運載體在受體細胞內，對外源基因進行大量、利用運載體在受體細胞內，對外源基因進行大量復制。復制。常用的載體有：常用的載體有： 質粒，質粒，噬菌體的衍生物，動植物病毒等噬菌體的衍生物，動植物病毒等能復制并帶著插能復制并帶著插入的目的基因一入的目的基因一起復制起復制有切割位點有切割位點有標記基因的存有標記基因的存在，將來可用含在，將來可用

5、含青霉素的培養基青霉素的培養基鑒別。鑒別。質粒質粒 質粒是基因工質粒是基因工程最常用的運載體，程最常用的運載體，它廣泛地存在于細它廣泛地存在于細菌中，菌中，是細菌染色是細菌染色體外能夠自主復制體外能夠自主復制的很小的環狀的很小的環狀DNA分子，分子，大小只有普大小只有普通細菌擬核通細菌擬核DNA的的百分之一。百分之一。1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序原核細胞的基因結構原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區非編碼區非編碼區編碼區編碼區編碼區上游編碼區上游 編碼區下游編碼區下游 與與RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點啟動子啟動子終止子終止子編碼區編碼區： 能轉錄，編碼蛋白質能

6、轉錄，編碼蛋白質非編碼區非編碼區： 不編碼蛋白質不編碼蛋白質, ,能調控遺傳信息表達能調控遺傳信息表達真核細胞的基因結構真核細胞的基因結構編碼區編碼區非編碼區非編碼區非編碼區非編碼區啟動子啟動子終止子終止子編碼區上游編碼區上游 編碼區下游編碼區下游 內含子內含子 外顯子外顯子 與與RNARNA聚合酶聚合酶結合位點結合位點編碼區編碼區：非編碼區非編碼區：外顯子：外顯子： 內含子內含子： 能編碼蛋白質的序列能編碼蛋白質的序列不能編碼蛋白質的序列不能編碼蛋白質的序列1）.什么是基因文庫？什么是基因文庫？2）.怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？種類：基因組

7、文庫：基因組文庫：部分基因文庫部分基因文庫：（cDNAcDNA文庫文庫)P10)P10基因的核苷酸序列等2 2、利用、利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因3 3、人工合成、人工合成 含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因含有一種生物的含有一種生物的部分部分基因基因根據基因的有關信息：如基因的轉錄產物根據基因的有關信息：如基因的轉錄產物mRNAmRNA直接分離法直接分離法: : ( (鳥槍法鳥槍法) )構建基因文庫構建基因文庫直接分離法直接分離法：供體細胞中的供體細胞中的DNADNA許多許多DNADNA片段片段運載體運載體限制酶限制酶分別與運分別與運 載體連接載體連接受體細胞受

8、體細胞分別分別 導入導入( (鳥槍法鳥槍法) )構建基因文庫構建基因文庫mRNA 反轉錄反轉錄cDNA(互補互補DNA） DNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA反轉錄法：反轉錄法：構建基因文庫構建基因文庫依據：目的基因的有關信息。依據：目的基因的有關信息。如：根據如：根據基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色體上的位置基因的功能、基因在染色體上的位置基因的轉錄產物基因的轉錄產物mRNAmRNA基因翻譯產物蛋白質等特性。基因翻譯產物蛋白質等特性。2如何從基因文庫中得到所需要的基因？如何從基因文庫中得到所需要的基因？ 概念概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復

9、制復制_的核酸合成技術的核酸合成技術 條件：條件：原理：原理： _聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA雙鏈復制雙鏈復制四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物熱穩定熱穩定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq酶酶）DNA的兩條鏈為模板的兩條鏈為模板一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列溫度控制和緩沖液溫度控制和緩沖液變性變性退火退火延伸延伸 方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_（n為擴增循環的次數）為擴增循環的次數） 結果：結果：指數指數2n使目的基因的片段在短時間內成百使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增萬倍地擴增化學方法人

10、工合成：化學方法人工合成：基因較小，核苷酸序列已知，可以基因較小，核苷酸序列已知，可以利用利用DNA合成儀人工合成合成儀人工合成a、目的基因、目的基因b、啟動子、啟動子c、終止子、終止子d、標記基因、標記基因啟動子：啟動子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識別和結合的部聚合酶識別和結合的部位，有了它才能位，有了它才能驅動基因轉驅動基因轉錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質，最終獲得蛋白質終止子：終止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終能終止止mRNAmRNA的轉錄的轉錄標記基因標記基因的作用是的作用是為了鑒別為了鑒別受體細胞中是否含有目的基受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細因，從而將有目的基因的細胞篩選出來胞篩選出來目的目的：使目的基因在受體細胞中穩定存：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。的基因能夠表達和發揮作用。（二）（二）方法方法導入植物細胞導入植物細胞導入動物細胞導入動物細胞導入微生物