1、第三章 凝膠分離技術 凝膠是一種高分子聚合物，不溶于水，但遇水溶脹，形成三維空間結構。 凝膠又稱分子篩，對生物大分子物質具有篩分作用。 凝膠分離即是利用凝膠分子篩的篩分作用對物質進行分離的操作。優點：1、凝膠為不帶電荷的惰性物質，不與溶質分子發生任何作用，因此分離條件溫和，產物收率高，重現性好；2、應用范圍廣，所分離物質分子量覆蓋面大，可分離從幾百到數百萬分子量的物質；3、設備簡單，操作方便，周期短，可反復使用。 凝膠分離已成為一種通用的分離方法，在生物大分子物質（蛋白質、酶、核酸、激素、多糖等）的制備與生產技術中被廣泛應用。第一節 凝膠分離原理一、凝膠分離原理 當被分離物質的分子大小不同時，

2、能夠進入到凝膠內部的能力也不同。凝膠中的孔隙大小與分子大小有相仿的數量級。當混合物通過凝膠時，比孔隙小的分子可以自由進入凝膠內部，而比孔隙大的分子就不能進入，因此在移動速度方面就出現差異，從而使不同相對分子質量的各組分得到分離。分離原理可用下式表示： VR = V0 + kVi式中：VR：保留體積（洗脫體積） V0：柱床內存在于凝膠外面的水相體積 外水體積 Vi：凝膠顆粒內部所含的水相體積 內水體積 k：分配系數 被分離物質分子很大，被完全排阻于凝膠顆粒之外： k = 0，VR = V0 ； 被分離物質分子很小，能完全自由進入凝膠顆粒內部： k =1，VR = V0 + Vi ； 中等大小的分

3、子，只能達到部分凝膠顆粒內部： 0 k 1，V0 VR V0 + Vi。Vo、Vi的測定Vo的測定 選用分子量約200萬的藍色葡聚糖-2000（或一種不被凝膠滯留的有顏色的大分子物質，便于觀察)，測定它的洗脫曲線，洗脫峰峰頂洗出的體積就是該柱的Vo值。 Vi的測定 選用一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測出其洗脫體積，減去Vo就是該柱的Vi 。常用鉻酸鉀(黃色)或有UV吸收的物質如N-乙酰酪氨酸乙酯來測定。分配系數k的計算： k = （VR-V0）/ Vi分子量與洗脫體積的關系：lgMr=-kVR+Vo（成立？）Mr很大時，達到上限？Mr很小時，達到下限？二、常用凝膠葡聚糖凝膠(dext

4、ran gel，Sephadex)聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel，Bio-Gel P)瓊脂糖凝膠(agarose gel，Sepharose)瓊脂糖及葡聚糖組成的復合凝膠(Superdex) 此外還有葡聚糖醚、聚甲基丙烯酸醋、聚苯乙烯等制成的凝膠1、葡聚糖凝膠 葡聚糖凝膠在水、醇、乙二醇、甲酸胺、二甲基甲酸胺、二甲亞楓等溶劑中都可吸液膨脹, 但吸收溶劑的量與膨脹后的體積視溶劑而異。凝膠充分膨脹的時間隨交聯度而不同, 交聯度越小所需時間越長, 加熱可以縮短吸水膨脹時間。葡聚糖和3-氯-1，2環氧丙烷以醚鍵相互交聯形成。按交聯度大小分8種型號，G值代表不同交聯度。 Sepha

5、dex G-10，15，25，50，75，100，150，200數字表示每克干膠膨脹時吸水量的10倍。 Sephadex G-25代表每克干膠膨脹時可以吸水2.5克。葡聚糖凝膠 葡聚糖凝膠只能應用于水溶性物質與水溶液或類水溶液, 但如在葡聚糖分子上引入有機基團則可以增大其有機性質而使之呈親脂性。如LH-20型葡聚糖凝膠即為在G-25型凝膠上引入羥丙基基團, 使糖分子與醚鏈相連。這種凝膠既有親水性, 又有親脂性, 可以在多種有機溶劑中膨脹后應用, 如氯仿、丁醇、四氫呋喃、二氧六環等, 但在苯、乙酸乙酯等溶劑中膨脹不多, 較少應用。用氯仿時,因凝膠比重較小, 所以要采取措施, 使凝膠不能浮起, 也

6、可改用上行法。2、聚丙烯酰胺凝膠3、瓊脂糖凝膠 瓊脂糖凝膠與前二種不同, 它不是以化學鍵共價鍵交聯的, 而是以氫鍵交聯, 不同的孔隙程度是由改變瓊脂糖的濃度而達到的,因此穩定性有一定限制。沒有干的凝膠, 必須在膨脹狀態保存, 遇脫水劑、冷凍和有機溶劑即破壞。pH在4-9之間、溫度在0-40之間穩定, 超出此范圍即破壞。三、凝膠特性參數1、排阻極限：指不能擴散到凝膠網絡內部的最小分子的相對分子質量，即相對分子質量大于該數值的分子不能進入到凝膠網絡中，其洗脫體積為Vo。 如Sephadex G50的排阻極限為30000。2、分級范圍：即能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質的相對分子質量范圍。

7、 如Sephadex G50的分級范圍為1500-30000。3、凝膠粒徑：凝膠一般為球形，其粒徑越小，HETP（理論板當量高度）越小，分辨率越高。 凝膠粒徑多用篩目或微米表示。如軟粒凝膠一般為50-150微米（100-300目），硬粒凝膠一般為5-50微米。4、空隙體積：指柱中凝膠之間空隙的體積，即Vo。 空隙體積可用相對分子質量大于排阻極限的溶質測定，如相對分子質量為200萬的水溶性藍色葡聚糖。5、溶脹率：溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分數稱為溶脹率，即 溶脹率=100% 如Sephadex G50的溶脹率為500%30%。6、床體積：指1克干膠充分溶脹后所占有的體積。 如Sephade

8、x G50的床體積為9-11mL/g干膠。 凝膠的床體積可用于估算裝滿一定體積的凝膠柱所需的凝膠干粉量。 第二節 凝膠分離應用 凝膠分離特點(1)溶質與介質不發生相互作用，操作條件溫和，回收率可接近100%；(2)批次之間不需要進行苛刻的介質清洗或再生，容易實現循環操作；(3)分離機理簡單、操作參數少、容易規模放大；(4)僅根據分子量進行分離，選擇性較低，處理量小。一、凝膠的選擇與處理1、排阻范圍的選擇2、粒度的選擇3、凝膠用量的選擇 干凝膠用量（g）：r2h/床體積 理論用量（1+10%）=凝膠處理量4、凝膠的處理（1）除去影響流速的過細顆粒 “水力浮洗法”：將顆粒粗細不均的凝膠懸浮在大體積

9、的水中，讓它自然沉降，過細的顆粒浮在上面，倒去即可。反復幾次。（2）溶脹 使用前需直接在欲使用的洗脫液中浸泡溶脹。通常使用“熱法”溶脹，即在沸水浴中，將懸浮于洗脫液中的凝膠漿逐漸升溫到近沸，12小時即可。 沸水溶脹不但節省時間，還可以殺滅凝膠中污染的細菌并排除氣體。（3）為了保證流速穩定，獲得較好的實驗結果，使用前用傾瀉法傾去不易沉下的較細顆粒，使凝膠顆粒大小一致。 5、柱結構（、h）的選擇柱太短，影響分離效果；柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當：內徑過細（小于1cm），會發生“器壁效應”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果；過大

10、（大于5cm）則稀釋現象嚴重。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例：對于除鹽來說應為15125；對于純化蛋白質來說應為1201100。二、凝膠分離操作技術1、凝膠裝柱 將層析柱垂直裝載支架上，將下端輸液管夾緊； 向柱中加入約1/3體積的0.9NaCl溶液（或洗脫液）； 將一細玻棒伸入柱內，靠近管內壁，順著玻棒緩慢的向管內加入混勻的凝膠溶液； 凝膠加至層析柱頂端約3cm時，打開柱下端輸液開關，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2min。 連續而緩慢的加凝膠直到穩定在離管口約5cm處。注意：防止空氣進入凝膠床 裝柱操作注意事項： 灌注凝膠時要求將均勻的凝膠一直加到所需柱床高度，不能時斷時續，否

11、則將出現分層或“紋路”等毛病。若出現這些現象，可以用玻璃棒將已經形成的柱床逐步攪起，直至出毛病的地方，再繼續加入攪勻的凝膠懸液。若在灌好凝膠后才發現“紋路”、分層等現象時，要重新裝柱，以免影響層析效果。在做大型的凝膠柱時，灌注的凝膠是否均勻往往從表面上看不出來，所以使用前應用一些帶色的大分子物質如細胞色素C、血紅蛋白或專用的藍色葡聚糖2000（Blue dextran-2000）通過凝膠柱，以檢查形成的帶色斑帶是否整齊，若斑帶歪斜，應該重新裝柱，直至達到要求。注1：剛從冰箱中取出的凝膠液，不能馬上用來灌柱，應平衡至室溫后再用，不然裝好的凝膠柱會產生大量的氣泡影響層析。注2：在整個灌注凝膠的過程

12、及使用中，凝膠柱面上一定要覆蓋著一層溶液，以免進入空氣。若進空氣，在加入溶液時，凝膠柱中易形成氣泡。注3：裝好的凝膠柱，使用時應該用相當于柱體積兩倍或更多的洗脫液流過洗脫柱，以壓實凝膠。2、樣品的上柱及洗脫加樣量的控制分析：1-2ml/100ml床體積，制備：10-30ml/100ml床體積 洗脫液的選擇：首先洗脫液最好與浸泡凝膠時所用的溶液一致，否則由于更換溶劑，凝膠體積會發生變化而影響分離效果；水溶性物質的洗脫用水或具有不同離子強度和pH的緩沖液，非水溶性物質的洗脫用有機溶劑（苯、丙酮等）。葡聚糖基本上不帶電荷、呈惰性，不與被分離的物質發生反應，所以分離的效果較好。然而由于是葡萄糖的聚合物

13、，因而仍有少量的活性羥基，能吸附少量蛋白質等被分離的物質。為了克服這個缺點，一般使用含有離子強度達0.08的NaCl等中性鹽作洗脫液。凝膠層析加樣操作示意圖圖注：1、平衡好的層析柱。2、沿管壁將樣品溶液小心加到凝膠床面上，應避免將床面凝膠沖起。3-4、打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內，同時收集流出液，5-7、當樣品溶液流至與膠面相切時，夾緊下口夾子。按加樣操作，用1mL洗脫液沖洗管壁2次。8-9、最后加入34mL洗脫液于凝膠上。10、連接柱層析系統，自動收集記錄。凝膠分離洗脫與自動收集系統實物圖凝膠層析中的分離行為藍葡聚糖（蘭色）、血紅蛋白（紅色）、鉻酸鉀(黃色)3、凝膠的回收與保存 凝膠一次

14、裝柱后可以反復使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02的疊氮化鈉，在下次層析前將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。 如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70、90、95乙醇脫水平衡至乙醇濃度達90以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。三、影響凝膠分離的因素1、流速對蛋白質分辨率的影響2、黏度對分辨率的影響3、凝膠柱層析操作壓 操作壓的增加會影響流速（變快？變慢？），此外還可以導致凝膠膠面下降，柱床容積的改變，相應測出的Vt，Vo，Ve等也改變，造成實

15、驗結果的誤差。操作壓與流速的關系4、加樣量對分辨率的影響 I .加樣量少時，A、B二種物質完全分開。 II.加樣量適當時，A、B 二種物質剛剛分開。III.加樣量太大時，A、B二種物質只能部分分開。（1）分析工作時，樣品體積為柱床體積的14%； 制備分離時，樣品體積為柱床體積的2530%。（2） 分離體積（Vsep=Ve1-Ve2） 當樣品體積Vsep時，兩個相鄰組分不能完全分離。5、凝膠粒徑對分辨率的影響 粒徑小的分離較好, 分辨度較高, 但流速低； 粒度大的流速高, 但洗脫峰較為扁平, 分辨度也較差。 從分析角度考慮, 以用較細顆粒與較慢流速為好。四、凝膠分離的應用 主要應用范圍：分級分離

16、各種抗原與抗體；去掉復合物中的小分子物質，如除鹽、熒光素和游離 的放射性同位素以及水解的蛋白質碎片；分析血清中的免疫復合物；分子量的測定。脫鹽：高分子（如蛋白質、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達柱床體積的25-30，為了防止蛋白質脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發性鹽類。用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質的分離提純。凝膠對熱原有較強的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。高分子溶液的濃縮：通常將Sep