1、植物與氮素營養的關系及氨基酸轉運蛋白的分類摘要：氮素是陸地生態系統中植物生長發育必需的元素，氨基酸作為植物體內重要的有機氮化合物在植物生長代謝中起著非常重要的作用，氨基酸轉運蛋白是位于生物膜上轉運氨基酸的蛋白家族，主要由歸屬于兩個超家族的八個亞家族成員構成，家族成員的氨基酸殘基數在400650之間，含有8-14個不等的跨膜結構域。本論文收集氨基酸轉運蛋白家族成員的序列信息進行系統發育及保守性研究，并針對部分有代表性的成員進行了序列的分析和結構的預測。氨基酸轉運蛋白被劃分為8個亞家族，在亞細胞結構中的分布存在較大的差異。關鍵詞：氮；喬木；基因組；序列分析；生物信息1、 氮的重要性氮是植物生長發育

2、過程中必需的大量元素之一，其對作物最終產量的貢獻高達40%-50%，是植物體內蛋白質、核酸、磷脂和一些生長激素的重要組成部分。植物體內的氮素水平直接或間接的影響著植物的光合作用：氮元素不僅作為葉綠素的重要組成，也在暗反應中通過影響關鍵酶活性對碳同化速率產生影響；同時，氮元素可以NO的形式作為信號分子可以參與植物生長發育過程的調控1。地球上大部分氮元素存在于巖石圈和大氣圈中。在大氣中，以分子態氮為主的惰性氣體占到大氣總量的78%；土壤中的氮元素主要以硝酸鹽的形式存在。環境中的氮元素大部分不能夠被植物直接利用，需要通過微生物的生物化學反應轉化為可利用的形式被植物吸收。氮素是植物生長發育所必須的營養

3、元素，也是提高生產能力的主要限制因子，由此，增加土壤的氮肥力和研究植物氮同化途徑來提高植物的氮利用率就顯得尤為重要。目前，氮肥的利用效率較低，僅30%，且氮肥的過量使用造成的負面影響也愈演愈烈，因此，從植物代謝的角度增加氮的利用率就顯得尤為重要。許多喬木品種是泛原生態環境中的多年生森林植物，其生活環境由于地表徑流的作用導致氮元素無法被充分利用，因此，對于喬木物種來說，氮素營養對其有相對其他物種更為重要的作用。二、 氮素循環在自然界，氮元素以分子態（氮氣）、無機的化合態氮和有機的化合態氮三種形式存在。大氣中含有大量的分子態氮，但是絕大多數生物都不能夠利用分子態的氮，只有像豆科植物的根瘤菌一類的細

4、菌和某些藍綠藻能夠將大氣中的氮氣轉變為硝態氮（硝酸鹽）加以利用。巖石和礦物中的氮被風化后進入土壤，一部分被生物體吸收，一部分被地表徑流帶入海洋。海洋接納了來自土壤和大氣的氮，其中的一部分被生物體吸收。生物體死后，生物體內的氮一部分以揮發性氮化合物的形式進入大氣，一部分又返回土壤，還有一部分以沉積物的形式沉積在大洋深處。植物只能從土壤中吸收無機態的銨態氮（銨鹽）和硝態氮（硝酸鹽），用來合成氨基酸，再進一步合成各種蛋白質。動物則只能直接或間接利用植物合成的有機態氮（蛋白質），經分解成為氨基酸后再合成自身的蛋白質。在動物的代謝過程中，一部分蛋白質被分解為氨、尿酸和尿素等排出體外，最終進入土壤。動植物

5、的殘體中的有機氮則被微生物轉化為無機氮（氨態氮和硝態氮），從而完成生態系統的氮循環。森林植物與周圍環境構成的小型生態系統所具有的氮循環類型包括兩個方面：開放式氮循環（open nitrogen cycle）和閉合式氮循環（closed nitrogen cycle）。在開放的氮循環系統中，包括喬木在內的一些植物能夠保持持續性的生長，即使在土壤溫度不適宜氮元素的合成和吸收的情況下，植物也能夠通過利用早春蓄積在體內的氮元素和葉片生長過程中果實代謝所產生的氮元素來維持自身生長3，因此，開放式氮循環系統不容易缺失氮元素而導致生長受阻。在閉合式的氮循環系統中，生長在極端環境中的森林植物通過限制生長來保持

6、氮素的可利用性4，其氮素營養的特點有以下幾個方面：（1），外部氮元素的補充少；（2），流失到外部環境中的氮元素也少；（3），由于低效率的硝化和反硝化作用，植物向體外釋放的含氮氣體少；（4），生態系統中大部分的氮素由植物枯枝落葉的腐蝕、礦化作用以及微生物的腐蝕提供5。鑒于其生態系統的特點，這類森林植物的主要N源是與具有硝化作用的根際微生物競爭得到的氨基酸和氨化合物6，而其生長也是季節性的。在土壤溫度不適宜N素吸收時，植物體內儲存的氮素營養以及代謝活動均能夠支持植物的季節性生長7。3、 植物從土壤中吸收氮元素的形式（1）無機氮的攝取當一種氮素化合物滿足以下條件時，該化合物能夠被植物利用：(i)氮素

7、化合物以植物可利用的形式存在于土壤中；(ii) 植物體具有能夠調節的系統（轉運體）來吸收該化合物；(iii)植物具有內源性代謝系統來利用該種化合物8。氮素吸收效率由對應的轉運體的豐富程度、活動性以及根表面積決定，菌根菌的作用能夠極大的促進根系吸收氮素化合物的效率9。植物通過根系從土壤中攝取的氮素化合物一般以銨鹽和硝酸鹽為主，攝取NH4+和NO3-通過轉運體的轉入以及轉出來實現。目前，將含氮離子轉出的運輸機制研究較少，其可能的代謝途徑有兩個方面：通過離子通道運輸到細胞外或通過具有轉出作用的轉運體蛋白被動運輸到細胞外10。植物中有兩個蛋白家族主要進行無機氮的轉運，即NH4+ 轉運蛋白（ammoni

8、um transporters ，AMT）以及NO3-轉運蛋白（nitrate transporters，NRT）兩個家族，在不同植物中，兩家族成員蛋白的數目有較大的差別。植物中，應用計算機預測的方式推測其含有14個不同的AMT家族成員，而在擬南芥和水稻中，AMT家族僅有6個和10個不同的成員11。造成這種差異的原因在于進化上產生的基因組的重復。通過系統發育分析，預測出的這些AMT家族成員可以分為兩個不同的亞家族AMT1和AMT2。NRT家族成員在喬木植物中的研究較少，但在對擬南芥的研究中發現，NTR依據不同的結合效率被劃分為兩個基因家族：低結合率的轉運蛋白歸為NTR1，高結合率的轉運蛋白歸為

9、NTR212。由于多數基因家族成員存在于喬木種族的數量多于擬南芥和水稻，可以推測喬木種族內NTR家族的成員數目也將多于擬南芥中的11個。（2）有機氮的攝取除無機氮化合物外，土壤中還含有包括自由氨基酸、肽鏈和蛋白質在內的有機氮化合物，盡管氨基酸在土壤有機氮化合物中所占比例很小13，但諸多學者還是將對植物吸收有機氮化合物的研究重點放在了氨基酸上。對松科植物的研究發現，與無機氮化合物的吸收速率相比，植物對氨基酸的轉運速率低于NH4+但高于NO3-14。土壤中的自由氨基酸來源于土壤微生物、菌根菌和植物根系分泌的蛋白水解酶在適宜pH條件下的蛋白水解作用15，但水解產生的氨基酸大部分被土壤微生物攝取吸收，

10、僅有小部分能夠被植物根系吸收利用6。氨基酸進入植物細胞通過質子協同運輸的方式由氨基酸轉運蛋白完成，即一或兩個質子與一個氨基酸共同進入細胞16。植物全基因組研究確定了至少5個亞家族共計134個基因位點屬于氨基酸轉運蛋白17，與擬南芥67個已鑒定的氨基酸轉運蛋白2相比，是其數目的兩倍。氨基酸轉運蛋白具有時間、空間表達的特異性以及酶作用底物的特異性，其功能也可能出現冗余性和基因不表達的特點18。四、氨基酸轉運蛋白氨基酸轉運蛋白在動物和植物中的種類存在差異，一般來講，植物中的氨基酸轉運蛋白分為三個大的家族：ATF（amino acid transporter family）、APC（amino aci

11、dpolyaminecholine）和MCF（Mitochondrial carrier family）。1 ATF家族ATF家族是通常所指的氨基酸轉運蛋白家族，也稱AAAP- amino acid/auxin permease-family，是植物中最先報道的氨基酸轉運蛋白家族。家族中包含六個亞家族：AAP亞家族、LHT亞家族、ProT亞家族、GAT亞家族、ANT亞家族以及AUX亞家族。1.1AAP亞家族Amino acid permeases即氨基酸通透性酶，是目前研究最多的氨基酸轉運蛋白亞家族，在擬南芥中，該家族共有八個成員，其中AtAAP1 到AtAAP6以及 AtAAP8已被證明選擇

12、性轉運中性氨基酸以及谷氨酸19, 20。AAP家族在擬南芥中表現出了較強的組織和底物特異性，亞家族成員間的功能有由較大的區分。如 AtAAP1在擬南芥子葉及胚乳中表達，在根基氮元素富集的情況下，可能將氨基酸轉運至根細胞內21；AtAAP2在擬南芥果實的導管組織中表達，其作用可能與氨基酸長距離運輸有關22；AtAAP3主要在根系導管組織細胞中表達，但該蛋白也在開花前的雄蕊有關短時間的表達，其功能可能與從植物韌皮部或土壤攝取氨基酸有關23；AtAAP5可能與篩管從營養組織運輸氨基酸并將氨基酸轉入正在生長的種子中有關，由于AtAAP5能夠與AtLHT1協同作用對轉運陽離子氨基酸起到重要作用，因此At

13、AAP5可能是根基攝取氨基酸系統最重要的組成成分24。1.2LHT亞家族Lysine/histidine transporters即賴氨酸/組氨酸轉運蛋白，研究表明，家族成員對中性和酸性氨基酸具有高的結合強度，因而采用其結合底物來命名該種氨基酸轉運蛋白。以模式生物擬南芥為研究對象來研究LHT亞家族成員LHT1表明，該蛋白具有組織特異性，主要在花、幼葉以及果實中表達25。1.3ProT亞家族轉運亞氨基脯氨酸、谷氨酸甜菜堿、相關的四氨基化合物以及-氨基丁酸，與轉運底物結合效率較為平穩或僅有較低的結合率26。1.4 GAT亞家族-aminobutyric acid transporters，即-氨基

14、丁酸轉運體蛋白，轉運-氨基丁酸（-aminobutyric acid，GABA）以及-氨基丁酸相關的化合物。目前，對擬南芥GAT亞家族成員AtGAT1 的研究表明，AtGAT1是一種由H+驅動的與轉運底物有強結合的-氨基丁酸轉運蛋白，除能夠轉運GABA外，它還能夠轉運-氨基脂肪酸和丁胺。與其他非-氨基丁酸轉運蛋白相比，AtGAT1沒有與之相似的序列組成。脅迫或敏感環境下，GABA在植物體富集，AtGAT1表達量提高，正常生活條件下，AtGAT1在花中表達量最高27。1.5 ANT 亞家族Aromaticand neutral amino acid transporter，芳香族和中性氨基酸轉運

15、蛋白，對芳香族氨基酸以及中性氨基酸在細胞膜的運輸起作用，擬南芥AtANT1不僅能夠轉運芳香族和中性氨基酸，也能夠轉運吲哚乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸。RNA凝膠印記分析表明，AtANT1在所有組織中均能夠表達，但在花和莖葉組織中表達量最高28。1.6 AUX亞家族Auxin-resistant，生長素耐受性轉運蛋白。生長素（auxin）是一種植物生長激素，在結構上與色氨酸有關，擬南芥生長素耐受性轉運體AtAUX1參與生長素的轉運，也參與吲哚乙酸IAA的轉運29。ATF家族各亞家族在底物選擇和結合效率上的不同說明了各家族空間表達的特異性，從側面反映出不同家族在植物生長發育中起著特定的作用。對一些模

16、式生物氨基酸轉運蛋白系統進化的研究表明，高等植物氨基酸轉運蛋白具有較強的保守性，但同源的轉運蛋白在物種之間仍具有組織和表達水平的特異性。2 APC家族植物中第二大氨基酸轉運蛋白家族是多胺膽堿氨基酸轉運體家族（amino acidpolyaminecholine，APC）。在原核生物（真細菌和古細菌）、真核生物（寄生蟲、真菌以及動物）中，該家族成員表現出相似性。植物的APC家族主要包括兩個亞家族：CAT亞家族和LAT亞家族。2.1 CAT亞家族Cationic amino acid transporters即陽離子氨基酸轉運蛋白，該亞家族成員在植物中和動物中有較強的同源性，擬南芥中該家族蛋白有1

17、1-14個不等的假定跨膜區，并且都屬于高結合力的堿性氨基酸轉運蛋白，在細胞中主要存在于質膜和液泡膜上30。近期對于植物CAT家族蛋白PtCAT11的研究表明，PtCAT11能夠選擇性地轉運谷氨酸31。2.2 LAT亞家族L-type amino acid transporters即L型氨基酸轉運蛋白，也稱為糖蛋白相關的氨基酸轉運蛋白，其中的L型指的是異源二聚體蛋白的輕鏈，LAT亞家族成員主要轉運異源二聚體蛋白的輕鏈所需要的氨基酸。由于該亞家族成員蛋白在動物體中的同源蛋白需要與糖蛋白互作來正確結合作用底物，在通過異源表達系統分析該亞家族蛋白的功能時需要能夠與之相互作用的蛋白來輔助研究，因此，目前

18、為止，關于該亞家族蛋白生化性質的研究報道非常少2。3 MCF家族精氨酸和瓜氨酸是細胞儲存氮素的主要形式，同時，兩者也參與細胞生物合成和代謝途徑。細胞代謝產生的精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸分布在胞質溶漿及線粒體中，因此，線粒體膜上必然存在轉運系統來進行上述氨基酸的運輸，而分布在線粒體內膜上轉運氨基酸的穿梭載體即被稱為線粒體載體家族（mitochondrial carrier），構成的家族稱為mitochondrial carrier family，即MCF32。MCF不僅存在于動物和微生物中，也存在于植物中，在擬南芥中發現的一種MCF家族成員能夠轉運堿性氨基酸，并且其對底物的選擇性與人類中的MCF家族

19、蛋白相似。總結：氮素是植物必需的三大營養元素之一，對植物的生長有著重要作用，氮素是氨基酸及其他很多化合物的組成成分，氮素不足會導致幼苗生長緩慢、葉子退綠變黃、植株高度明顯降低，葉片柔弱無力。國內外許多學者均對氮素營養進行了研究。此外，把植物必需的礦質元素用適當的無機鹽配成營養液，即可使植物正常生長，并且溶液培養其元素的種類和數量可以控制，因此溶液培養是研究植物的重要環節。參考文獻1吳巍，趙軍, 植物對氮素吸收利用的研究進展J. 中國農學通報, 2010. 13(26): p. 75-78.2 Rentsch, D.S., S.Tegeder, M., Transporters for upta

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