1、紫外可見分光光度法一、定義二、原理三、應用四、紫外可見分光光度計一. 定義定義紫外可見分光光度法紫外可見分光光度法:是通過測定被測物質在紫外可見光區的特定波長處或一定波長范圍內的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法。紫外可見分光光度法紫外可見分光光度法一般是在200760nm波長范圍內選擇。二. 原理原理 1.透光率或透光度T ：透過光的強度為t與入射光的強度為0之比稱透光率或透光度，用表示，即：Tt/0*100 2.吸光度A: 透光率的倒數反映了溶液對光的吸收強度，其定義為：AlgT；T=10-a。3.實踐證明，溶液對光的吸收程度，與該溶液的濃度、溶液液層的厚度及入射光的波長等因素有關。

2、當入射光的波長保持不變，則溶液對光的吸收程度與溶液的濃度和溶液液層的厚度有關。朗伯和比爾分別于1760年和1852年研究了光的吸收與溶液的濃度和溶液液層的厚度的定量關系。即：朗伯比爾（LamLert-Beer）定律：當一束平行的單色光通過濃度一定的某一含有吸光物質的溶液時，在入射光的波長、強度以及溶液的溫度等保持不變的條件下，該溶液的吸光度A與溶液液層的厚度L成正比。 A=ECL 或 C=A / EL 其中：A為吸光度； C為溶液濃度； E為常數，稱為吸收系數； L為光通過溶液的長度，單位為cm；吸光系數E在一定的條件下是一個常數，它與入射光的波長、物質的性質及溶液的溫度等有關。吸光系數是物質

3、的特性常數之一，表明物質對某一特定波長光的吸收能力。當溶液的濃度為1（C=1），光通過溶液的長度為1cm時，E=A,稱為百分吸收系數（E1%1cm）,表示為 E1%1cm A / C L。三. 應用1 定性1.1鑒別方法：物質的定性就是對物質作鑒定，用紫外可見吸收光譜對物質進行鑒定時，主要根據光譜上的一些特征吸收，包括最大吸收波長、最小吸收波長、肩峰、吸收系數、吸收度比值等。（1）對比吸收光譜圖的一致性(將試樣與其標準品配成相同濃度的溶液)（2）對比吸收光譜特征數據的一致性（最大吸收波長和吸收系數）（3）對比吸收度（或吸光系數）的比值的一致性a.吸收峰: 曲線上吸收最大值且比左右相鄰都高之處稱

4、為吸收峰，它所對應的波長稱為最大吸收波長b.谷: 峰與峰之間且比左右相鄰都低之處稱為谷，它所對應的波長稱為最小吸收波長c.肩峰 : 在吸收峰旁形狀像肩的小曲折處叫尖峰d.末端吸收: 吸收光譜曲線波長最短的一端，呈現強吸收，吸收度相對大但不成峰形的部分1.2雜質檢查：利用不同化合物的紫外光吸收不同（具有特征吸收波長）進行雜質檢查。 1.純度檢查 2.雜質限度檢查（有時可利用峰谷吸光度比值控制雜質賢亮） 2. 定量 2.1單組分的定量方法 (1)標準曲線法 測定時,先配制一系列濃度不同的標準溶液,在同一條件下分別測定吸光度,考查濃度與吸光度成直線關系的范圍,然后以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制

5、A-c關系曲線，或叫工作曲線。如符合比爾定律，將得到一條通過原點的直線。也可用直線回歸的方法，求出回歸的直線方程。再根據樣品溶液所測得吸光度，從標準曲線或或回歸方程求得樣品溶液的濃度。 (2) 對照品比較法按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分標示量的10010%，所用溶劑也應完全一致，在規定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸收度后，按下式計算含量，即得。計算式 A樣W對/稀釋倍數1001 含量（%）= - 100% A對W樣/稀釋倍數1001 (3)吸光系數法按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規定的波長處測定其吸收度，再以

6、該品種在規定條件下的吸收系數計算含量。用本法測定時，應注意儀器的校正和檢定。 計算式 A樣 含量（%）= - 100% W樣/稀釋倍數(E)對10012.2多組分的定量方法(1)解線性方程法(2)等吸收雙波長消去法3.藥典中多用于制劑的含量測定。（1）對照品比較法 根據 A樣=E樣C樣L樣 A對=E對C對L對 其中 E樣E對 L樣L對 A樣 C樣 得出 C樣C對A樣A對 A對 C對 W對 N對A樣樣品的百分含量原料藥為：100 W樣N樣 A對 W對 N對A樣W平均片劑、膠囊劑或顆粒劑等為：100 W樣N樣A對規格 W對 N對A樣注射液為：100 V樣N樣A對規格N為稀釋度，規格表示每片（或粒或

7、袋或支 ）含主藥的克數（見P243-245例1、例2，注意：注意：求校正因子f時保留五位有效數字）（2）吸收系數法（前提條件:已知吸收系數E1%1cm，通常大于100，并保證分光光度計性能優良，應選擇在最大吸收度狹縫處測定）（見P246-249例1、例2、例3）根據 A樣=E樣C樣L樣 L樣1 A樣樣品的百分含量原料藥為： 100 E1%1cm1100W樣N樣 A樣W平均片劑、膠囊劑或顆粒劑等為： 100 E1%1cm1100W樣N樣規格 A樣注射液為： 100 E1%1cm1100V樣N樣規格例1：維生素B12注射液含量測定 精密量取本品適量，加水制成每ml約含維生素B12 25g的溶液，照

8、紫外可見分光光度法在361nm波長處測定吸收度，按維生素B12吸收系數（E1%1cm）為207計算即得。（規格為1ml：1mg） 具體操作：精密量取本品5ml，置250ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，以水為空白，在361nm波長處測定吸收度為0.409。 A樣百分含量 100 E1%1cm1100V樣N樣規格 0.409 10098.8。 207110051/2500.001例2：氯氮卓片含量測定 取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于氯氮卓30mg），置100ml量瓶中，加鹽酸溶液（91000）70ml，充分振搖使氯氮卓溶解，用鹽酸溶液（91000）稀釋至刻度，搖勻，用干燥濾紙濾

9、過，精密量取續濾液5ml，置另一100ml量瓶中，用鹽酸溶液（91000）稀釋至刻度，搖勻，照紫外可見分光光度法，在308nm的波長處測定吸收度，按氯氮卓吸收系數（E1%1cm）為319計算，即得。（規格為10mg）具體操作：取本品20片，稱定：1.7320g，研細，精密稱取0.2546g，按上述方法操作，測定吸收度為0.460。具體操作：取本品20片，稱定：1.7320g，研細，精密稱取0.2546g，按上述方法操作， 測定吸收度為0.460。 A樣W平均百分含量 100 E1%1cm1100W樣N樣規格 0.4601.732020 10098.1。 31911000.25461/1005/

10、1000.01(3)計算分光光度法(對儀器要求較高，多采用雙波長法)(4)比色法四紫外可見分光光度計 紫外-可見分光光度計其應用波長范圍為200400nm的紫外光區、400760nm的可見光區。主要由光源、單色器、吸收池、檢測器、指示器等主要部件組成。（一）主要部件 1.光源：是提供入射光的裝置，分光光度計對光源的要求是能發射強度足夠而且穩定的連續光譜。常用光源有：鎢燈（可見光），氘燈（紫外光）。2.單色器：其作用是將來自光源的復合光，按波長順序色散分離出所需波長的單色光。常用的色散元件是棱鏡或光柵，由棱鏡或光柵和狹縫組成。3.吸收池：也叫比色皿或比色杯，在分光光度法分析中，用來盛放樣品溶液的

11、器皿。用光學玻璃制成的吸收池，只能用于可見光區；用熔融石英（氧化硅）制的吸收池，適用于紫外光區，也可用于可見光區，吸收池必須匹配，厚度應一致，盛同一溶液，在所用波長處測吸光度，兩者誤差應在0.2-0.5%之內。4.檢測器：是測量光線透過溶液以后強弱變化的裝置，其作用是檢測光信號，并將光信號轉換成電信號，一般采用光電管或光電倍增管。使用前應校正測定波長并按儀器說明書進行操作。（二）分光光度計的光學性能 1.波長的準確度試驗 可用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進行校正或用氧化鈥玻璃檢定。 2.吸光度準確度 用重鉻酸鉀硫酸溶液檢定，測定吸收度，在換算成E1%1cm，允差范圍為1。

12、 3.雜散光 通常以光強較弱的波長處（如220nm，340nm處），所含雜散光的強度百分比作為指標，采用1碘化鈉在220nm測得透過率應0.8；采用5亞硝酸鈉在340nm測得透過率應0.8，即符合規定。（三）注意事項1.空白溶液與供試品溶液必須澄清，不得有渾濁。2.測定時，除另有規定外，應以配制供試品溶液的同瓶溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池,石英吸收池必須潔凈，必須配對（盛裝同一溶劑，在規定波長測定吸收池透光率，應小于0.3），否則要引入測定誤差。3.一般供試品溶液的吸收度讀數，以在0.30.7之間的誤差較小。4. 測定前應先檢查所用溶劑在測定波長附近是否符合要求，每次使用同一廠牌批號，混合均勻的溶劑。（220240nm,A應0.4；241250nm，A應0.2；251300nm, A應0.1；300nm以上，A應0.