1、齊齊哈爾醫學院免疫教研室齊齊哈爾醫學院免疫教研室第八章第八章 熒光免疫試驗熒光免疫試驗 Fluoroimmunoassay 掌握：掌握：熒光的基本知識；熒光抗體染色熒光的基本知識；熒光抗體染色與結果判斷。與結果判斷。熟悉：熟悉：熒光物質。熒光物質。了解：了解：熒光抗體的制備；熒光顯微鏡的熒光抗體的制備；熒光顯微鏡的基本結構；熒光免疫分析；熒光免疫基本結構；熒光免疫分析；熒光免疫技術的應用。技術的應用。教學目的教學目的第一節第一節 熒光免疫試驗的組成因素熒光免疫試驗的組成因素第二節第二節 間接免疫熒光試驗間接免疫熒光試驗第三節第三節 流式熒光免疫試驗流式熒光免疫試驗第四節第四節 其他與熒光檢測相

2、關的免疫試驗其他與熒光檢測相關的免疫試驗第五節第五節 熒光免疫試驗的臨床應用熒光免疫試驗的臨床應用第六節第六節 影響熒光免疫試驗的主要因素影響熒光免疫試驗的主要因素熒光免疫試驗（熒光免疫試驗（fluoroimmunoassay):fluoroimmunoassay): 以熒光物質標記抗體和抗原，通過與以熒光物質標記抗體和抗原，通過與相應抗原或抗體發生特異性結合反應，以相應抗原或抗體發生特異性結合反應，以此對待測物進行此對待測物進行定位、定性和定量定位、定性和定量分析的分析的檢測技術，具有高度檢測技術，具有高度特異性、敏感性和直特異性、敏感性和直觀性觀性，是，是最早最早出現的免疫標記技術。出現的

3、免疫標記技術。 熒光物質吸收激發光的能量后，熒光物質吸收激發光的能量后，電子從電子從基態基態躍遷到躍遷到激發態激發態，當其回，當其回復至基態時，以發射光形式釋放出復至基態時，以發射光形式釋放出能量，稱為能量，稱為熒光熒光。 第一節第一節 熒光免疫試驗的組成要素熒光免疫試驗的組成要素吸收能量吸收能量激發態激發態 基態基態熒光效率熒光效率熒光特點：熒光特點： 1 1 可產生熒光的分子或原子在接受可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發光；能量后即刻引起發光； 2 2 一旦停止供能，熒光隨之瞬間消一旦停止供能，熒光隨之瞬間消失；失；( (一一) )熒光的基本知識熒光的基本知識1.1.發射光譜發射

4、光譜: :指固定激發光波長，在不指固定激發光波長，在不同波長下記錄到的標本發射熒光的譜圖。同波長下記錄到的標本發射熒光的譜圖。2.2.激發光譜激發光譜: :指固定檢測發射光波長，指固定檢測發射光波長，用不同波長的激發光照射標品得到的熒用不同波長的激發光照射標品得到的熒光的譜圖。光的譜圖。 一一 熒光及熒光物質基礎知識熒光及熒光物質基礎知識熒光效率熒光效率 吸收光的光量子數（激發光強度）吸收光的光量子數（激發光強度）發射熒光的光量子數（熒光強度）發射熒光的光量子數（熒光強度）熒光色素本身的物理特性熒光色素本身的物理特性激發光強度及激發光波長激發光強度及激發光波長決定于決定于決定于決定于3.熒光物

5、質將吸收的光能轉變成熒光的百分率熒光物質將吸收的光能轉變成熒光的百分率-熒光效率熒光效率定義定義: :熒光物質被激發后所產生熒光物質被激發后所產生的熒光衰減到一定程度時所用的的熒光衰減到一定程度時所用的時間。時間。各種熒光物質的熒光壽命不同各種熒光物質的熒光壽命不同。 4.4.熒光壽命熒光壽命5.5.熒光淬滅熒光淬滅: :熒光物質在某些理化因素熒光物質在某些理化因素作用下，發射熒光減弱甚至消退稱為作用下，發射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。熒光淬滅。如紫外線照射、高溫（如紫外線照射、高溫（2020）、苯）、苯胺、酚、硝基苯、胺、酚、硝基苯、I I- -等等 。如何避免：如何避免： 勿長時間照射勿

6、長時間照射 脈沖瞬間照射脈沖瞬間照射 避光保存避光保存猝滅劑：猝滅劑：具有熒光猝滅作用的物質具有熒光猝滅作用的物質熒光淬滅熒光淬滅 熒光物質熒光物質最大吸收最大吸收光譜光譜最大發射光譜最大發射光譜應用應用異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素 (FITC)(FITC)490490495nm495nm520520530nm 530nm （黃綠色）（黃綠色）FATFAT、熒光偏振免、熒光偏振免疫測定疫測定四乙基羅丹明四乙基羅丹明 (RB200)(RB200)570570575nm575nm595595600nm600nm（橙紅色）（橙紅色）FITCFITC的襯比染色或的襯比染色或雙標記雙標記FATFAT藻紅

7、蛋白（藻紅蛋白（PEPE）490-490-560nm560nm595nm595nm（紅色）（紅色）雙標記雙標記FATFAT、流式、流式細胞術細胞術7-7-氨基氨基-4-4-甲基香豆素甲基香豆素354nm354nm430nm430nm（藍色）（藍色）雙標記或多標記雙標記或多標記FATFATEuEu3+3+螯合物螯合物340nm340nm613nm613nm時間分辨熒光免疫時間分辨熒光免疫測定測定（二）熒光物質（二）熒光物質熒光顯微鏡熒光顯微鏡 利用一定波長的激發利用一定波長的激發光對待測標本進行激發，光對待測標本進行激發，產生一定波長的熒光，產生一定波長的熒光，對組織細胞結構或其組對組織細胞結構

8、或其組分進行定性、定位和半分進行定性、定位和半定量分析檢測。定量分析檢測。 二、熒光顯微鏡二、熒光顯微鏡隔熱濾光片：隔熱濾光片： 位于位于燈室聚光器前，燈室聚光器前， 作用作用阻斷紅外線通過而隔熱。阻斷紅外線通過而隔熱。 激發濾光片：激發濾光片： 位于光源和物鏡之間，位于光源和物鏡之間， 作用能選擇性地透過紫外線可作用能選擇性地透過紫外線可 見波長的光域，提供合適的激發光。見波長的光域，提供合適的激發光。 吸收濾光片：吸收濾光片： 位于物鏡和目鏡之間，位于物鏡和目鏡之間， 作用阻斷激發光而使發射的熒作用阻斷激發光而使發射的熒 光透過，保護眼睛。光透過，保護眼睛。熒光顯微鏡熒光顯微鏡濾光片濾光片

9、透射光：透射光：照明光線從標照明光線從標本下經聚光器透過標本本下經聚光器透過標本進入物鏡。進入物鏡。落射光：落射光：照明光線從標照明光線從標本上經垂直照明器落射本上經垂直照明器落射到標本，經標本反射進到標本，經標本反射進入物鏡。入物鏡。透射熒光顯微鏡光路透射熒光顯微鏡光路(a)(a)落射熒光顯微鏡光路落射熒光顯微鏡光路(b(b) )熒光顯微鏡熒光顯微鏡光路光路1 1、抗體要求、抗體要求 高特異性高特異性 高親和力高親和力 經純化提取經純化提取IgGIgG 三、熒光素三、熒光素-抗體結合物抗體結合物v有能與蛋白質形成共價健的化學基團有能與蛋白質形成共價健的化學基團v熒光效率高，熒光效率高，v熒光

10、色澤與背景組織的色澤對比度高。熒光色澤與背景組織的色澤對比度高。v與蛋白質結合后不影響蛋白質原有性質。與蛋白質結合后不影響蛋白質原有性質。v標記方法簡單、安全無毒。標記方法簡單、安全無毒。v與蛋白質的結合物穩定，易于保存。與蛋白質的結合物穩定，易于保存。2 2 熒光素要求熒光素要求一、基本原理一、基本原理特異性抗體與相特異性抗體與相應抗原反應，熒應抗原反應，熒光素標記的抗抗光素標記的抗抗體再與第一抗體體再與第一抗體結合。結合。 間接熒光抗體染色法示意圖間接熒光抗體染色法示意圖 第二節第二節 間接免疫熒光試驗間接免疫熒光試驗間接免疫熒光法示意圖間接免疫熒光法示意圖間接法：間接法： 優點：優點：敏

11、感度高于直接法敏感度高于直接法 制備一種熒光抗體可檢測多種抗原制備一種熒光抗體可檢測多種抗原 既可用于檢測抗原，也可檢測抗體既可用于檢測抗原，也可檢測抗體 缺點：缺點：易出現非特異性熒光易出現非特異性熒光 方法較麻煩方法較麻煩 操作時間較長操作時間較長 應用：應用：自身抗體的檢測自身抗體的檢測 標本片上滴加特異性抗體標本片上滴加特異性抗體3730min PBS3730min PBS洗滌洗滌 滴加二抗滴加二抗 3730min PBS3730min PBS洗滌洗滌 鏡檢鏡檢二、實驗方法二、實驗方法三、注意事項三、注意事項1.1.熒光染色時間：一小時內或熒光染色時間：一小時內或2828保存保存4 4

12、小時，小時，2.2.三種對照：陽對：陽性血清三種對照：陽對：陽性血清+ +熒光標記物熒光標記物 陰對：陰性血清陰對：陰性血清+ +熒光標記物熒光標記物 熒光標記物對照：熒光標記物對照：PBS+PBS+熒光標記物熒光標記物3.3.標本片需保持濕潤，避免干燥標本片需保持濕潤，避免干燥4.4.滴加抗體或熒光標記物滴加抗體或熒光標記物, ,始終保持在未知抗原標本始終保持在未知抗原標本上上 - -：無或僅見極微弱熒光。無或僅見極微弱熒光。 + +：熒光較弱但清楚可見。熒光較弱但清楚可見。 + + ：熒光明亮。熒光明亮。 +：耀眼強熒光。耀眼強熒光。 特異熒光強度特異熒光強度+ +以上判定為陽性，對照光應

13、呈以上判定為陽性，對照光應呈- -或或。根據根據+ +的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。 熒光抗體染色及結果判斷熒光抗體染色及結果判斷第三節第三節 流式熒光免疫試驗流式熒光免疫試驗流式熒光免疫試驗流式熒光免疫試驗(flow cytometry and fluorescence immunoassay):采用人工微球和流式檢測方式對可溶性物質進行采用人工微球和流式檢測方式對可溶性物質進行高通量分析的檢測方法。高通量分析的檢測方法。懸浮陣列；流式微球陣列懸浮陣列；流式微球陣列 第第四節四節 其他與熒光檢測相關的免疫試驗其他與熒光檢測相關的免疫試驗其他熒光免疫試

14、驗其他熒光免疫試驗時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定熒光酶免疫測定熒光酶免疫測定熒光偏振免疫測定熒光偏振免疫測定自發熒光壽命短自發熒光壽命短:1ns:1ns10ns10ns鑭系元素壽命長鑭系元素壽命長:10s:10s1000s1000s短壽命熒光完全衰變后再測定短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光鑭系元素特異熒光 （一）基本原理（一）基本原理時間分辨檢測原理示意圖時間分辨檢測原理示意圖1.1.時間分辨時間分辨一、時間分辨熒光免疫測定一、時間分辨熒光免疫測定2.stokes2.stokes位移位移: :激發光譜和發射光譜的激發光譜和發射光譜的波長差波長差。 stokesstokes位

15、移小，相互干擾，影響結果準確位移小，相互干擾，影響結果準確性。性。鑭系元素鑭系元素StokesStokes位移大位移大(273nm)(273nm)，激發，激發光譜和發射光譜不重疊光譜和發射光譜不重疊時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定發射光譜帶較窄：發射光譜帶較窄：613nm613nm10nm10nm，干擾，干擾少少 激發光譜帶較寬：激發光譜帶較寬：300nm300nm350nm350nm，靈敏，靈敏度高度高3.3.發射光譜和激發光譜發射光譜和激發光譜時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定4.4.熒光標記物的相對比活性熒光標記物的相對比活性比活性比活性 ：單位時間內每個標記分子：單位時間

16、內每個標記分子可被探測到的信號量。可被探測到的信號量。EuEu3+3+螯合物螯合物 反復激發反復激發 10001000次次/ /秒秒大大提高了熒光標記物比活性大大提高了熒光標記物比活性時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定結合結合-二酮體二酮體EuEu3+3+解離解離酸性增強液酸性增強液熒光熒光增強增強EuEu3+3+標記標記抗原抗體抗原抗體復合物復合物5.5.信號增強信號增強時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定（二）標記物和（二）標記物和標記方法標記方法時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定（三）方法類型（三）方法類型 雙抗體夾心法雙抗體夾心法 固相抗體競爭法固相抗體競爭法 固相抗原

17、競爭法固相抗原競爭法時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定（三）方法類型（三）方法類型時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖圖靈敏度高靈敏度高：最小檢出量最小檢出量1010-18-18mol/Lmol/L分析范圍寬：分析范圍寬：4 45 5個數量級個數量級標記物穩定：有效使用期長標記物穩定：有效使用期長測量快速，易自動化測量快速，易自動化易受污染，本底增高易受污染，本底增高方法評價方法評價時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定光線通過偏振濾光片后，形成光線通過偏振濾光片后，形成一個方向的平面光稱為一個方向的平面光稱為偏振光偏振光。偏振熒光偏振熒光

18、( (綠光綠光,525nm,525nm550nm)550nm)偏振光偏振光( (藍光藍光,485nm),485nm)熒光物質熒光物質二、熒光偏振免疫測定二、熒光偏振免疫測定 抗原抗體競爭反應抗原抗體競爭反應AgAgF F分子小，轉動速度快，偏振熒光弱分子小，轉動速度快，偏振熒光弱 AgAgF F-Ab-Ab分子大，轉動速度慢，偏振熒光強分子大，轉動速度慢，偏振熒光強 若待檢抗原多，則若待檢抗原多，則AgAgF F-Ab-Ab少，少，AgAgF F多，偏振熒光弱多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強度成反比待檢抗原含量與偏振熒光強度成反比熒光偏振免疫測定原理示意圖熒光偏振免疫測定原理示意圖 基本

19、原理基本原理方法評價方法評價 樣品用量少樣品用量少 熒光素標記試劑穩定，使用壽命長熒光素標記試劑穩定，使用壽命長 重復性好重復性好 快速，易自動化快速，易自動化 適于小、中等分子物質檢測適于小、中等分子物質檢測 靈敏度較非均相熒光免疫測定法低靈敏度較非均相熒光免疫測定法低熒光偏振免疫測定熒光偏振免疫測定第第五節五節 熒光免疫試驗的臨床應用熒光免疫試驗的臨床應用1.1.血清中自身抗體檢測血清中自身抗體檢測抗核抗體抗核抗體( (均質型均質型) )抗核抗體抗核抗體( (核膜型核膜型) )抗核抗體抗核抗體( (斑點型斑點型) )一、間接免疫熒光試驗一、間接免疫熒光試驗2.2.各種微生物的快速檢查和鑒定

20、各種微生物的快速檢查和鑒定寄生蟲（猴胚腎細胞內弓形蟲）寄生蟲（猴胚腎細胞內弓形蟲）細菌（藤黃微球菌細菌（藤黃微球菌 ) )一、間接免疫熒光試驗一、間接免疫熒光試驗腫瘤（人肝癌細胞）腫瘤（人肝癌細胞）間接免疫熒光試驗間接免疫熒光試驗3 3、寄生蟲感染的診斷、寄生蟲感染的診斷4 4、白細胞分化抗原的檢測、白細胞分化抗原的檢測5 5、人類白細胞抗原的檢測、人類白細胞抗原的檢測6 6、腫瘤組織中腫瘤標志物的檢測、腫瘤組織中腫瘤標志物的檢測7 7、激素和酶的組織定位、激素和酶的組織定位（一）（一）時間分辨熒光免疫試驗時間分辨熒光免疫試驗二、其他熒光免疫試驗二、其他熒光免疫試驗1.1.內分泌學中的應用內分

21、泌學中的應用2.2.腫瘤學中的應用腫瘤學中的應用3.3.免疫學中的應用免疫學中的應用4.4.分子生物學的應用分子生物學的應用5.5.微生物學中的應用微生物學中的應用（二）熒光偏振免疫試驗（二）熒光偏振免疫試驗第六節、影響熒光免疫試驗的主要因素第六節、影響熒光免疫試驗的主要因素一、熒光素一、熒光素- -抗體結合物抗體結合物二、待檢標本二、待檢標本三、其他三、其他v熒光素熒光素- -抗體結合物的結合比率：抗體結合物的結合比率： F/P=F/P=nmnmAAA495280495nm35. 087. 2一、一、 熒光素熒光素-抗體結合物抗體結合物v抗體效價：抗體效價：雙向免疫擴散試驗雙向免疫擴散試驗v抗體純度：抗體純度：高親和力、單克隆抗體高親和力、單克隆抗體v抗體特異性：抗體特異性：吸收試驗、